旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族功能研究

Some parasitic nematode cysteine protease inhibitors have immunomodulation function and can suppress host immune response during invasion and are important factor for induction of host immune suppression.Trichinella spiralis, the largest intracellular parasitic nematode, can infect more than 150 kinds of animals including human and the life cycle can be completed within the same host. After infection the immune suppression could be observed in host but the effector molecular was not known yet. Our group has cloned three members (TsCystatin1, TsCystatin2, TsStefin) of cysteine protease inhibitor gene family from Trichinella and they showed different characteristics from other nematodes with special structure. The project intends to further identify cysteine protease inhibitor gene family from Trichinella, determine the differential expression in different species and isolates and at different developmental stages,reveal the biological activity,antigenicty and localization within parasite and the infected host tissue, study the modulation of murine DC and macrophages function and explore the role in parasite host interaction. This will not only help to reveal the mechanism of the Trichinella spiralis host interactions but also provide new ideas for the prevention and treatment of trichinellosis.

某些寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有免疫调节作用，在入侵时对宿主免疫应答有抑制作用，是诱导宿主免疫抑制的重要因子。旋毛虫可以感染包括人类在内的150多种动物，其生活史可在同一宿主内完成，是最大的细胞内寄生性线虫，而且感染宿主后可以引起免疫抑制现象，但是其效应分子仍不清楚。本课题组已经克隆到旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的3个基因（TsCystatin1，TsCystatin2，TsStefin），发现旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族与其它线虫不同，而且结构有特殊性。本项目拟进一步鉴定旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族，明确在旋毛虫不同虫种/分离株以及不同发育时期的表达差异；阐明其生物学活性、抗原性以及在寄生虫和宿主感染组织的定位情况；研究对树突细胞和巨噬细胞功能的调节作用；探讨在寄生虫与宿主相互关系中的作用。这不仅有助于揭示旋毛虫与宿主相互作用的机制，也会为旋毛虫病的防治提供新思路。

成功克隆了旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂TsCystatin基因家族的三个成员TsCystatin1，TsCystatin2和TsStefin，具有典型的半胱氨酸蛋白酶抑制剂保守结构域。TsCystatin基因家族在旋毛虫各个时期均可转录。在原核系统表达的TsCystatin重组蛋白具有蛋白酶抑制活性。TsCystatin重组蛋白对RAW264.7的增殖没有影响，但是可以增加IFN-γ激活的RAW264.7产生NO的量。TsCystatin重组蛋白stefin、cystatin1和cystatin2免疫小鼠后对旋毛虫感染保护效果不显著。旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂均定位在表皮及杆状体细胞中，推测可能参与免疫调节功能。对旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员进行了计算机模拟虚拟药物筛选，初步获得100种候选药物分子。克隆了旋毛虫组织蛋白酶B基因家族TsCB1～4基因，TsCB1的半胱氨酸残基活性位点变为丝氨酸残基，其它三种均具有完整的半胱氨酸蛋白酶结构域。TsCB在旋毛虫各时期均转录表达。在原核系统表达获得重组蛋白，TsCB4重组蛋白具有反应原性，TsCB2和TsCB3重组蛋白具有酶活性。克隆了旋毛虫组织蛋白酶F基因家族TsCF1、TsCF2和TsCF3，在原核表达获得的重组蛋白具有酶活性。TsCF在旋毛虫肌幼虫及成虫中均存在。TsCF1定位于表皮和杆状体、TsCF2定位于生殖原基、TsCF3定位于后肠、表皮和杆状体中。通过虚拟对接实验研究了TsCF1、TsCF2、TsCF3与E64和K11777之间的相互作用，将旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin 家族进行虚拟对接，获得组织蛋白酶F家族与cystatin家族之间的最适结合构象，显示cystatin家族可与组织蛋白酶F家族之间进行结合，这解释了cystatin 家族和组织蛋白酶F家族之间的抑制作用。将旋毛虫组织蛋白酶F家族与FDA药物库和天然代谢产物库进行对接和虚拟筛选，获得200种化合物。利用iTRAQ技术对旋毛虫三个发育时期（成虫、新生幼虫和肌幼虫）的虫体蛋白质进行了检测，共鉴定出4691个蛋白质。分析了旋毛虫三个不同发育时期差异表达的蛋白，其中肌幼虫时期表达上调的蛋白数量高于其他两个时期。对旋毛虫等5种线虫进行了正选择基因分析，结果显示鉴定出 986 个正选择基因。分析显示正选择基因主要被被聚类为包括代谢通路、信号