用于新药筛选的新型T4噬菌体纳米颗粒展示平台开发

Nowadays in drug discovery the drug screening step is more and more dependent on biophysical techniques that can directly evaluate the physical interaction (affinity) between drug target proteins and small molecule compounds. The available biophysical techniques have limitations on their application in drug high-throughput screening because they demand high quality sample preparation and bear complicated procedures. Thus, it is essential to establish a simple and highly efficient technique to measure the affinity between target proteins and small compounds. In this proposal we will develop a phage T4 nano particle platform, based on which the above mentioned affinity measuring technique will be established. Previous studies have indicated that the phage T4 capsid is an excellent nano particle platform for protein display. High molecular weight proteins can be displayed with natural conformations in high copy numbers. By using biochemical and molecular biology methods we will invent a novel in vivo parallel expression method to rapidly display active target proteins on phage T4 nano particles with high efficiency. With this nano particle platform we will also build a simple procedure to measure the affinity between the displayed target proteins and small compounds using mass spectrometry. This nano particle display platform will be utilized in ligand compound screening for several attractive target proteins.

在现代新药研发体系中，药物筛选越来越依赖于直接检测药物靶点蛋白与小分子化合物间的亲和性。现有的生物物理学方法对实验样品的制备要求较高，操作复杂，在药物高通量筛选方面的应用受到限制。因此，建立一个简便高效的检测靶点蛋白-小分子化合物亲和性的技术手段具有重要意义。T4噬菌体衣壳是一个良好的蛋白展示纳米颗粒，可高拷贝数展示天然折叠的较大蛋白分子。本项目将运用生化和分子生物学技术手段，建立一套新型的体内同步表达展示法，开发一个T4噬菌体纳米颗粒展示平台，高效快捷地展示活性靶点蛋白。利用这一平台，我们将结合质谱法开发一套便捷方法，检测所展示的靶点蛋白与小分子化合物之间的亲和性；并进一步利用此纳米颗粒展示平台，筛选针对数个热门靶点蛋白的配体化合物，用于下游新药开发。

本研究开发并完善了T4噬菌体表面同步展示技术，实现了外源蛋白T4噬菌体衣壳表面的便捷展示，并将T4噬菌体衣壳开发成为一个能高效展示有生物活性的外源蛋白分子的展示平台。本研究进一步评估了T4噬菌体表面同步展示技术的普适性，发现T4噬菌体体内同步表达展示法受到大肠杆菌表达蛋白的局限性影响，不适合用于展示人源药物靶点蛋白。由于原核细胞与真核细胞在蛋白表达及修饰体系上的巨大区别，本项目的研究未能成功的在大肠杆菌中表达出有功能的人体蛋白。在其他方面，T4噬菌体体内同步表达展示法获得了有效应用。一方面，这一技术被用于毒性蛋白、难溶蛋白的表达及展示。在这一应用方向上，我们利用了T4噬菌体表面同步展示技术成功表达了具有功能活性的毒性蛋白Serratia marcescens endonuclease。另一方面，T4噬菌体衣壳作为一个纳米级蛋白展示平台，十分适合开发成固定化酶平台，因此我们尝试使用这一展示技术对常用的工具酶肽N-糖苷酶F（PNGase F）进行固定化，初步取得良好效果。本研究对T4 噬菌体表面同步展示技术的开发、完善及适用范围的评估，实现了在T4噬菌体衣壳上高效快捷展示外源蛋白。这一新方法与传统噬菌体展示方法相比优势明显，是噬菌体展示领域的技术革新。而对其适用范围的评估明晰了这一技术的优势和短板，明确了其应用范围。在表达毒性蛋白和固定化酶这2个具有优势的应用方向上，我们进行了初步尝试并获得良好效果。另外，这一同步展示法能够更为简便的获得展示病原抗原的噬菌体颗粒，可以将T4噬菌体改造成更为方便的疫苗递送平台，加深T4噬菌体展示技术在疫苗开发领域的应用。由于同步展示法能十分简便的将外源蛋白展示在噬菌体衣壳上并保持活性，这一方法也可以实现高通量蛋白表达并应用于蛋白功能位点筛选的研究。我们在下一阶段的研究中将在这些应用方向上进行探索。由于同步展示法基于T4噬菌体对大肠杆菌的侵染，所展示的外源蛋白只能利用大肠杆菌的原核表达体系进行表达，可见在T4 噬菌体表面展示的蛋白种类受到限制。因此，我们在应用T4噬菌体表面展示技术和同步展示法时，需要考虑适用范围，充分利用其简便高效的优势，并避开短板。