改造T4噬菌体包装机器实现DNA可控跨膜转运及应用

The bacteriophage T4 DNA packaging machine is the strongest biological machine reported to date, which translocates DNA with extremely high force and efficiency. Evidences have shown that the basic components of T4 DNA packaging machine are simply two proteins, the portal protein gp20 and the motor protein gp17. In the in vitro buffer conditions, T4 packaging machine translocates substrate DNA without any specificity, and is controlled by ATP factitiously. Thus, removal of this packaging machine from T4 capsid and constitution onto man-made materials to make an artificial DNA translocation device will have broad potential applications. However, study of its application is hampered by the fact that one of the essential components, the portal protein gp20, is completely insoluble and loses activity when separated from the capsid. We solved this problem in our preliminary studies by making truncation constructs and using protein chaperons and produced gp20 in the biologically active form. We then fused it onto lipid membranes and formed an initial T4 DNA translocation device. We'll move forward to improve the assembly and activity of this artificial T4 DNA translocation device for controlled DNA cross-membrane transfer, and explore its applications on targeted DNA delivery for gene therapy and single-pore DNA sequencing, which are important directions of biotechnology and biomedicine fields.

T4噬菌体的DNA包装机器是迄今已知最强的生物机器，具有十分强大高效的DNA转运能力，其基本组成十分简单，仅包括门户蛋白gp20和引擎蛋白gp17。在体外缓冲液环境中，T4包装机器的转运底物DNA不具有特异性，可使用ATP实现人工调控。因此，把T4 DNA包装机器移植到人工材质上形成可控DNA转运装置，具有广泛的应用前景。然而，由于T4 DNA包装机器的重要组分门户蛋白gp20极不可溶，一旦脱离衣壳就失去活性，极大限制了T4 DNA包装机器的应用。在前期研究中，我们利用蛋白截短和添加分子伴侣等技术手段，突破了该技术难题，成功制备了具有生物活性结构的gp20。在此基础上，我们初步实现了活性T4 DNA转运装置在脂膜上的人工组装。下一阶段，我们计划深入细致的改进此人工组装的T4 DNA转运装置，完善其功能，实现DNA的可控跨膜转运，并在基因靶向治疗和单孔道DNA测序等重要方向上探索其应用。

本研究进行了对T4噬菌体门户蛋白gp20十二聚体的均一性和稳定性改造的系统性尝试，并利用gp20的一系列突变体进行了gp20蛋白的结构解析，获得了gp20的精细三维结构。但由于受到gp20和gp17蛋白自身性质的限制，本研究无论是在人工脂质体上，还是在平面脂膜上，均未能获得具有DNA转运活性的gp17-gp20复合体。进一步分析噬菌体衣壳冷冻电镜结构模型得出一个可能的假说，即gp17不仅与gp20结合，还与衣壳蛋白gp23结合，才能形成稳定的复合物。这一假说表明，仅用gp20和gp17在人工材料上进行组装，是不可能获得具有DNA转运活性的gp17-gp20复合体的。因此，本项目调整了研究内容，利用噬菌体衣壳进行酶的表达和固定化研究，取得了重要进展。利用噬菌体衣壳的自组装过程进行酶的表达，其优势在于，在衣壳的自组装过程中，外源蛋白的表达属于瞬时高效表达，而大多数酶类由于具有强大的生物活性，在表达过程中会对宿主造成伤害，具有毒性，因此利用衣壳自组装十分适合一般条件难以表达的酶类的高效表达。在这一方向上，我们成功表达了具有功能活性的毒性酶Serratia marcescens endonuclease和限制性内切酶。同时，T4 噬菌体衣壳作为一个纳米级蛋白展示平台，十分适合开发成固定化酶平台。利用其衣壳自组装，我们成功将β-半乳糖苷酶固定化在噬菌体表面并保持活性；将重要工具酶PNGase F（肽N-糖苷酶）固定化。初步建立了利用T4噬菌体衣壳自组装进行酶的表达和固定化的完整流程。本项目研究获得的gp20结构信息能帮助深入理解gp20在T4噬菌体装配过程中的作用机理，并推动其作为生物纳米孔的应用。而本项目建立的利用T4噬菌体衣壳自组装过程进行酶的表达和固定化的完整流程，由于其便捷、高效和低成本，将可成为酶工程学的全新研究方向，在降低工具酶使用成本、生物感应器开发等领域具有良好的应用价值。本项目的成果在以上方向上值得进行更深入的应用研究。