锌指核酸酶基因修复治疗地中海贫血的研究

地中海贫血（地贫）主要是由于基因缺失或变异而导致相应的珠蛋白缺失或不足。在全面综述国内外人诱导式多能干细胞（iPS ）相关研究进展和基因打靶技术进展，以及本项目组相关前期工作的基础上，针对广东地区是地贫高发区这一特点，提出建立无外源基因整合的地贫病人特异iPS细胞，构建组织特异表达的供体质粒，利用锌指核酸酶在iPS细胞的AAVS1位点（"安全港"）基因打靶目的基因（α或β基因），进而诱导基因打靶后的iPS细胞向造血干细胞和红细胞分化，最后获得能组织特异表达正常珠蛋白基因的iPS细胞。本项目的研究成果将为研究地贫发病机制提供实验模型，为最终达到利用iPS细胞进行基因治疗根治地贫提供理论基础。本项目的研究，不仅对利用iPS细胞和锌指核酸酶的理论与技术根治地贫有重要的学术价值，为基因治疗地贫提供了理想的移植细胞，其研究方法和技术对解决其他难治性遗传性疾病的治疗问题，具有重要的学术借鉴作用。

背景：. 地中海贫血（地贫）主要是由于基因缺失或变异而导致相应的珠蛋白缺失或不足，重型患者是家庭和社会的巨大负担，但目前除了异体干细胞移植没有根治的方法，而异体干细胞移植又存在供体不足、免疫排斥和费用高昂等问题。而患者特异的诱导式多能干细胞（iPS ），在进行基因修饰的基础上，有可能替代异体干细胞成为供体来源，其研究方法和技术对解决其他难治性遗传性疾病的治疗问题，具有重要的学术借鉴作用。.主要研究内容：建立无外源基因整合的地贫病人特异iPS细胞，构建donor 载体和g RNA，利用CRISPR-Cas9技术基因修饰地贫iPS细胞的缺陷位点，进而诱导基因打靶后的地贫iPS细胞向造血干细胞和红细胞分化，最后获得能组织特异表达正常珠蛋白基因的脱核红细胞。.重要结果：.1..获得了三个输血地贫患者的的iPS细胞系，目前生长良好。按照之前已经建立的“integration-free”再程序化方案，建立了外周血细胞来源的三个iPS细胞系（名字分别为HZK,HZX,HMT）。目前均已经完成鉴定。.2..更高效的诱导分化的方法。之前采用与OP9共培养的方法，将iPS细胞诱导分化为造血前体细胞的效率比较低。通过较长时间的摸索，结合文献资料，项目组现在采用两阶段法进行诱导分化，最终获得了脱核红细胞，脱核率约为2%-5%。.3..因为构建的锌指核酸酶载体转基因效率低，未能筛选出阳性细胞，转而进行CRISPR-Cas9转基因操作。成功构建了CRISPR-Cas9基因打靶的donor 载体和g RNA。.4..目前三个细胞系已经进行转染，并筛选出正确基因打靶的细胞，并已经完成向无核红细胞诱导分化。.关键数据及其科学意义：. 本项目将基因修饰后的地贫患者iPS细胞定向诱导分化，最终获得了成熟的、脱核红细胞，通过流式细胞仪筛选将脱核红细胞进行纯化，为基因治疗地贫提供了理想的移植细胞。本项目的研究，不仅对利用iPS细胞和锌指核酸酶的理论与技术根治地贫有重要的学术价值，其研究方法和技术对解决其他难治性遗传性疾病的治疗问题，具有重要的学术借鉴作用。