MAGE-RING泛素连接酶复合物的结构与功能研究

通过Tap-Tag纯化和质谱鉴定的方法，我们鉴定到17种新的MAGE-RING泛素连接酶复合物，对其中的MAGE-C2-TRIM28、MAGE-G1-NSE1和MAGE-A4-TRIM69等复合物进行了结构与功能研究，初步结果表明MAGE-C2-TRIM28复合物在乳腺癌细胞中调控抑癌基因p53蛋白的降解，初步阐明了MAGE-C2-TRIM28复合物与肿瘤发生、发展的关系及其机制。在本项目中，将继续寻找新的MAGE-RING复合物及其底物，运用分子生物学和细胞生物学的手段，对鉴定到的MAGE/E3复合物进行深入的功能研究，阐明其生物学功能及其作用机制；同时，通过解析这些蛋白复合物的晶体结构，揭示结构与功能之间的关系，进一步在分子水平上阐明其生物学功能的机制，为肿瘤的早期诊断和防治提供理论基础。

迄今为止在人类基因组中已经发现了近80个TRIM家族蛋白，TRIM家族蛋白的N端具有相对保守的三个基序：RING结构域、B-box结构域以及螺旋螺旋结构域，其C端的结构域具有多样性。由于TRIM家族中的很多成员都参与到包括先天性免疫、转录调控、细胞凋亡等各种机体的生命活动中，近年来对TRIM家族蛋白的研究受到越来越多的重视。TRIM家族蛋白由于RING结构域的存在，很多蛋白都被报道具有泛素连接酶活性。但是目前为止TRIM家族蛋白发挥活性的机制仍然没有被清楚地了解。已有的研究表明紧邻着RING结构的B-Box结构域是由RING结构域进化而来，但对其功能和对于TRIM蛋白行使E3连接酶的影响都不甚了解。同时，TRIM蛋白中保守的用于介导同源寡聚体以及异源寡聚体形成的coiled coil 结构域，对于TRIM蛋白有着怎样的作用也都处于未知状态。.我们通过X射线晶体学的方法对Trim69 CCD（coiled coil 结构域）进行了结构生物学研究，与之前研究所提出的TRIM家族蛋白二体或三体正向平行模型不同的是，晶体结构显示Trim69 CCD是反向平行的二体构象。结合生物信息学的序列比对，我们进一步揭示了CCD介导形成同源寡聚体及异源寡聚体的分子机制，即是由一些保守的疏水性氨基酸介导的相互作用。与此同时，我们根据得到的晶体结构构建了TRIM69全长蛋白模型。考虑到TRIM家族蛋白结构的保守型，我们以底物较明确切结构组成类似的TRIM25去验证模型。在成功地表达纯化得到TRIM25的突变体、截短体及全长蛋白以后，通过一系列的生化方法、细胞生物学方法并结合体内体外泛素化实验研究了TRIM家族蛋白发挥泛素化活性的机制，并同时对提出的全长TRIM蛋白的分子模型进行了验证。同时在研究过程中，我们发现N端有两个在序列组成连续的谷氨酸，它们对于TRIM25的E3活性无论是体内还是体外都表现出至关重要的作用，并且这两个酸性氨基酸的存在在TRIM家族的很多蛋白中显示出很强的保守性。.综上，我们利用结构生物学、生物化学、分子生物学以及细胞生物学等多种手段对于TRIM家族蛋白发挥泛素连接酶活性的分子机制进行深入研究，为未来TRIM家族蛋白的研究奠定了基础，为理解TRIM家族蛋白质在天然免疫、肿瘤发生、细胞分化、个体发育及细胞凋亡等过程中的调控机制提供了新的观点。