蝎形引物结合数字PCR技术检测脑脊液ctDNA突变新方法及其临床应用研究

As one representive liquid biopsy technology , the detection of circulating tumor DNA (ctDNA) has greatly promoted the diagnositics and treatment of malignant tumors. In gliomas, attributable to the existence of the blood-brain barrier, ctDNA is hardly detected in the plasma of affected patients, the detection of ctDNA in the cerebrospinal fluid (CSF) may provide a breakthough in the development of liquid biopsy technology of brain tumors. However, compared with tumor tissue, the content of ctDNA in body fluid is extremely low and the DNA fragments are much shorter, making accurate detection of ctDNA a major problem thus restricted its clinical application. In the previous study, combining digital PCR with scorpion primers, we established a novel, highly sensitive and specific detection method for genetic mutations. Using this method, in this study, we will develop detection systems for the well-known molecular biomarkers of glioma, the IDH1mutation and TERT mutation. The performance of the established methods will be evaluated, including sensitivity, specificity and accuracy analysis. Then, by determination of IDH1 and TERT mutations in matched tissue and CSF samples, the concordance of DNA mutation status between CSF and tumors will be analyzed; Finally, we will measure the CSF-derived ctDNA mutation content at different stages of treatment, and compare the results with patients’ prognosis and therapy response. This will enable us to clarify the value of CSF -derived ctDNA detection in glioma prognosis and therapeutic monitoring. The completion of this project will be valuable to promote the development and application of liquid biopsy technology in glioma.

以循环肿瘤DNA（ctDNA）为代表的液体活检技术极大推动了恶性肿瘤的诊治。在脑胶质瘤中，血脑屏障的存在使患者血液中很难检测到ctDNA，脑脊液中ctDNA的检测则成为脑肿瘤液体活检技术发展的突破口。但是，相对于肿瘤组织，体液中ctDNA含量极低，片段小，其准确检测一直是困扰临床应用的问题所在。本实验室将数字PCR技术与蝎形引物相结合，建立了一种高灵敏度、高特异性的基因突变检测方法。采用此方法，本课题拟建立胶质瘤个体化治疗分子标志物IDH1和TERT基因突变检测技术，对所建方法的灵敏度、特异性和准确性等性能进行评估；并通过配对的组织和脑脊液样本中基因突变的测定，分析脑脊液ctDNA突变与组织样本的一致性，最后分析不同治疗阶段脑脊液ctDNA突变含量变化与患者预后、疗效之间的关系，探讨其在胶质瘤预后评估和治疗监测中的价值。该研究可为胶质瘤液体活检技术的发展和应用提供重要的理论依据。

基于肿瘤活检组织的分子分型极大推动了恶性肿瘤的诊治。然而，脑肿瘤组织取材存在着诸如有创、风险高、不能反复取材和异质性等局限性。以循环肿瘤DNA（ctDNA）为代表的液体活检手段，侵入性小，可重复取样，且能够实时追踪肿瘤基因组变化，克服肿瘤的异质性，为个体化治疗的实施提供了有效工具。但是，相对于肿瘤组织，体液中ctDNA含量极低，片段小，其准确检测一直是困扰临床应用的问题所在。本研究基于芯片式数字PCR技术，建立了胶质瘤重要的分子标志物IDH1 R132H突变、TERT启动子突变的数字PCR检测方法，并通过阴阳性质粒标准品和临床样本（101例配对胶质瘤肿瘤组织样本和血液样本、30例配对的脑脊液样本）的研究，对检测方法的灵敏度、特异性进行了验证和评估。检测数据表明所建立检测技术的灵敏度均为100%，特异性在97.9%以上，确认了所建立方法的准确性和可靠性；分析了血液和脑脊液ctDNA分子标志物检测结果与配对组织的一致性，发现脑脊液与肿瘤组织基因突变的符合率（80%-83.3%）明显高于血浆与肿瘤组织基因突变的符合率(70%-79%)；分析了组织和血液中标志物变化与患者无进展生存期的关系，发现无论是组织或血浆样本中，IDH1 R132H突变与PFS延长显著相关，而TERT突变和PFS缩短显著相关；最后分析了血液和脑脊液中基因突变含量实时变化与患者治疗效果和疾病进展的关系，发现血液中ctDNA突变含量显著低于脑脊液，血液或脑脊液中IDH1或TERT突变含量变化能够反映疾病进展状态和治疗效果，当患者对治疗有应答，肿瘤负荷降低的时候，突变含量与治疗前相比大幅度降低；当患者对治疗出现耐受，疾病进展的时候，突变含量又逐步上升。以上结果证实基于数字PCR技术的胶质瘤ctDNA检测技术在胶质瘤临床诊断和治疗中的有效性，同时也初步明确了血液和脑脊液ctDNA分子变异在临床患者预后和疗效评定方面的应用价值。