高灵敏检测肺癌外周血中EGFR基因突变的数字PCR芯片研究

Lung cancer is one of the most malignant tumors with high morbidity and mortality in the world. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKIs), as a molecular targeted drug, improve the survival and quality of life for advanced non-small cell lung cancer patients. As the best biomarker, EGFR gene mutation is correlated with its efficacy and drug resistance. So, whether the mutation of EGFR gene is exist in lung cancer patients should be detected firstly. The TKIs can be as the first line treatment in these patients at advanced stages with EGFR mutation. Most of patients at the advanced stages had lost chances of surgery, the tissues samples of these kinds of patients can't get. The peripheral blood is easy to get for these kinds patients. However, the mount of circulating DNA in peripheral blood is relatively low and the mutant DNA is less, which is difficult to detect. The digital PCR chip was conduct to detect the few mutants. The DNA molecules will be divided into thousands of emusion droplets with nanoliter, in which there is zero, one,or two copy of DNA. These DNA molecules were amplified with allele specific primer amplification and detected with TaqMan probes with fluorescent. The fluorescent signal of every emusion droplets will be detected or scanned with fluorescent microscopy or scanner. Then, the amount of mutant DNA molecules will be calculated. One high sensitive and specific detection method for EGFR mutation will be conducted with this digital PCR chip. The EGFR mutation of peripheral blood samples will be detected with these digital PCR chips and the application in targeted treatment of lung cancer will be analyzed.

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs）作为一种分子靶向药物，可以提高晚期非小细胞肺癌患者的生存率和生活质量。但这类药不是对所有肺癌患者都有效，EGFR的基因突变与其药效及耐药性密切相关，准确、高效地对患者尤其是晚期患者外周血进行EGFR基因突变测定，对患者进行有针对性的靶向药物治疗具有重要的临床意义。鉴于外周血中肿瘤细胞产生的循环DNA量比较少、突变DNA分子更少的特点，通过制作含有纳升级乳滴微反应器的数字PCR芯片，将待测DNA分子分散到上万个纳升级的乳滴中，结合位点特异性扩增及Taqman荧光探针，通过检测每一乳滴的信号获得EGFR突变情况，利用建立的EGFR基因突变检测方法，研究外周血与组织标本EGFR基因突变的一致性，在此基础上探索一种新的外周血EGFR基因突变的高灵敏、高特异检测方法，为肺癌靶向药物的治疗提供依据。

数字PCR（Digital PCR，dPCR）是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法，还是一种可以在大量的野生型DNA背景中鉴定出微量突变体的方法。循环DNA是存在于外周血、滑膜液等体液中的细胞外DNA，肿瘤患者循环DNA的产生主要来源于肿瘤细胞的释放，循环肿瘤DNA检测在肿瘤诊断、靶向用药及预后监测中具有重要的指导意义。表皮生长因子受体EGFR在高达40~80%的非小细胞肺癌NSCLC中发生突变，而且发生突变的患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs）这类靶向药物疗效显著。因此，用数字PCR技术高灵敏的检测肺癌患者外周血中的EGFR基因突变，可以为肺癌靶向药物的精准治疗提供依据，具有重要的临床应用意义。.基于以上需求，我们首先构建了基于MGB探针的荧光定量PCR（qPCR)扩增体系，可检测EGFR基因4个外显子Exon 18、19、20、21的29中突变位点，检测效果可与目前市售的EGFR检测试剂盒相当，检测灵敏度为1%。由于微流控技术在微流体操控方面的优势，可以将样品分解为纳升甚至皮升级，获得更多的样品分解数目。基于此优势，我们开发了一种基于矿物油饱和PDMS材料制备液滴数字PCR芯片技术（ddPCR）的方法，克服了由于PDMS油吸收能力强造成的乳滴不稳定现象，而且与目前数字PCR芯片技术相比，成本低，操作简便，对配套设备的要求不高。EGFR突变检测灵敏度达到0.01%。在此基础上，课题组又开发了更加简单易操作的基于双面玻璃储液腔的数字PCR芯片，避免了PCR扩增过程中的乳滴不稳定现象。此款芯片的制作、加工更加方便、快捷，有利于数字PCR技术在临床上的大量推广。.利用上述构建的数字PCR芯片，共检测了80份NSCLC患者外周血标本，ddPCR检测出突变率（62.5%）明显高于qPCR（26.3%）；在配对组织标本（12份））检测方面，ddPCR 检测敏感性也高于qPCR；另外，只有在NSCLC血清标本中可以检测到EGFR基因突变，SCLC及正常人中均未检到突变，说明外周血基因突变检测具有良好的特异性。外周血循环肿瘤DNA基因突变高灵敏检测作为一种非侵入性的检测方法就有很大的应用潜力。