铜绿假单胞菌调节c-di-GMP合成酶SiaD活性及生物被膜形成的分子机制研究

Pseudomonas aeruginosa is an important opportunist human pathogen, causing severe and persistent infections in immune compromised individual and cystic fibrosis sufferers. Bacterial second messenger cyclic-dimeric-GMP regulate the transition from motile to sessile lifestyles. P. aeruginosa is able to activate the activity of diguanylate cyclase SiaD in response to environment signal. However, the underlying mechanism is not clear so far. Our research revealed that siaD gene and its co-transcribed genes pa0170 pa0171 siaA involves in biofilm formation. Our bacterial two hybrid assay showed that PA0170 was able to directly interact with SiaD, PA0171 and SiaA. In this proposal, we will systematically investigate the interaction network between these proteins and elucidate the underlying mechanism for SiaD activation using technique in molecular biology, biochemistry and structural biology. Meanwhile, we will detect the effect of these protein on bacterial pathogenesis. These results will expand our fundamental understanding of the biofilm formation and chronic infection of p. aeruginosa, which will provide a theoretical basis for the developments fo the novel anti-pathogenic drugs targeting c-di-GMP for prevention of the bacterial infections.

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上重要的致病菌之一，严重危害着人类生命健康。第二信使c-di-GMP调控着该菌急慢性感染的转换。铜绿假单胞菌可响应环境压力调节c-di-GMP合成酶SiaD的酶活性，但其分子机制尚不清楚。我们研究发现siaD及相邻基因pa0170,pa0171和siaA参与生物被膜形成，且细菌双杂交结果表明PA0170与另外三个蛋白皆可直接作用。我们推测上述四基因组成了一个c-di-GMP信号系统，调控着细菌生物被膜的形成。本项目拟利用免疫共沉淀、GST pull-down等相关技术，研究上述四个蛋白之间的相互作用网络，揭示铜绿假单胞菌激活SiaD活性的分子机制，并利用动物模型研究它们对细菌致病性的影响。预期结果将加深对铜绿假单胞菌生物被膜形成及慢性感染发生机制的认识，为开发基于c-di-GMP信号为靶点的新型药物或治疗策略提供理论基础。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上重要的致病菌之一，严重危害着人类生命健康。一般而言，铜绿假单胞菌具有急性和慢性感染两种状态。第二信使c-di-GMP调控着该菌急慢性感染的转换。铜绿假单胞菌通过编码多种c-di-GMP合成和降解酶，可应对不同的细菌内外部压力变化。本项目针对一种c-di-GMP合成酶SiaD的生物学功能、激活机制及反馈调节机制进行了研究。为了探究c-di-GMP合成酶SiaD的生物功能及其机制，本项目进行了以下研究。首先，通过细菌运动检测、结晶紫染色等表型检测方法，我们发现SiaD对细菌的运动能力无显著影响，而对细菌聚集和生物被膜的形成具有显著调节作用。其次，利用细菌双杂交、GST pull down等方法，我们发现SiaD与其相邻基因所编码的蛋白PA0170具有相互作用。通过体外纯化，得到SiaD、SiaD突变体及PA0170蛋白后，我们进行了酶活检测实验，结果表明PA0170的存在可以显著激活SiaD的酶活性，从而促进细菌c-di-GMP的合成，及下游细胞聚集或生物被膜的形成。最后，c-di-GMP合成酶一般都存在着产物反馈抑制机制，为此，我们对SiaD的反馈抑制机制进行了探究，并着重对R119M突变体的功能进行了研究。我们发现R119M突变虽然并不影响SiaD与PA0170之间的相互作用，却影响着SiaD的酶活性及胞内生物被膜形成；据此我们猜测R119氨基酸可能是一个可以结合c-di-GMP信号分子的关键氨基酸，在SiaD的功能过程中起着重要作用。这些结果揭示了SiaD的生物学功能及机制，加深对铜绿假单胞菌生物被膜形成及慢性感染发生机制的认识，为开发基于c-di-GMP信号为靶点的新型药物或治疗策略提供理论基础。