HIF-1α/RhoC/ROCK2/Vimentin通路在肝癌血管化拟态中的分子机制研究

Our results have demonstrated that anti-vascular endothelial growth factor treatment elicits vasculogenic mimicry formation by regulating HIF-1α, and ROCK is involved in vasculogenic mimicry formation in hepatocellular carcinoma (HCC), but the molecular mechanisms of HIF-1α effecting ROCK in vasculogenic mimicry is not elucidated. It was repoted that RhoC was involved in metastasis through vasclular invasion and we have found that ROCK2 plays more important role on vasculogenic mimicry in HCC campared with ROCK1 indicates that RhoC/ROCK2 may be involved in vasculogenic mimicry formation. We also found that inhibition of ROCK could decrease Vimentin expression and ROCK2 effect Vimentin more than ROCK1 suggests that Vimentin may be downstream of ROCK2. To confirm this hypothesis, this project intends to investigate the HIF-1α/RhoC/ROCK2/Vimentin signalling pathway in the vasculogenic mimicry in HCC, and explore the multi-target selective intervention treatment of cancer therapy.

课题组已经证实抗肿瘤血管生成后诱导HIF-1α表达促进血管化拟态(VM)形成，ROCK参与肝癌VM形成，但HIF-1α如何影响ROCK参与VM形成的机制还未完全阐明。有研究表明RhoC参与肿瘤对血管侵袭，前期研究肝癌实验结果显示，与沉默ROCK1比较，沉默ROCK2明显抑制VM形成，推测RhoC/ROCK2可能参与VM形成；我们还发现ROCK抑制剂逆转Vimentin升高，进一步与ROCK1 shRNA比较，ROCK2 shRNA降低Vimentin表达更显著，推断可能是ROCK2直接调节Vimentin参与VM形成。据此本项目欲从临床肝癌样本找到RhoC与VM的关系，双向调节HIF-1α，检测RhoC的变化，阐明ROCK2的地位，寻找调节Vimentin的靶点，最终揭示HIF-1α/RhoC/ROCK2/Vimentin通路在VM形成中的分子机制，探讨多靶点干预治疗肝癌的可行性。

血管化拟态（VM）改善包括肝细胞癌（HCC）在内的多种恶性肿瘤的血液供应。然而，在HCC中，RhoC/ROCK在VM形成中的潜在机制尚未被研究。与癌旁组织相比，RhoC在肝癌组织中表达上调（P<0.01），其中在VM阳性（VM+）组表达上调，RhoC高表达患者生存时间缩短（P<0.001）。SK-Hep-1中RhoC敲除显著降低VM的形成和细胞运动。相反，当RhoC在HepG2中过表达时，细胞的运动性和VM的形成明显增强。为了进一步评估ROCK1和ROCK2对VM的潜在作用，我们在MHCC97H细胞中敲除ROCK1或ROCK2。与ROCK1-shRNA相比，ROCK2-shRNA在体内外对VM的形成、细胞的运动、VM的关键因子和上皮间充质转化（EMT）标志物有重要影响。此外，随着RhoC的变化，P- ERK等水平均明显改变，而ROCK2对PFAK表达影响不大，提示ROOC对FAK／PAXILN信号转导的调节作用不通过ROCK2。总之，我们的结果表明RhoC/ROCK2可能通过ERK/MMPs信号对HCC的VM有重要影响，可能是治疗HCC的潜在靶点。.ROCK、P21活化激酶（PAK）、缺氧或上皮间充质转化（EMT）有助于VM的潜能。然而，这些生物学现象的具体机制尚未完全阐明。本课题组采用Kaplan Meier分析法预测缺氧与HCC预后的关系：诱导因子（HIF-1α）、EMT相关标志物Vimentin与患者预后的相关性。采用CD34/PAS双染法对VM+和VM-进行鉴别。分别乏氧培养（1% O2）或正常培养条件下培养细胞，采用qPCR和免疫印迹法检测乏氧对RhoA/ROCK影响。用HIF-1α小干扰RNA、ROCK稳转株研究HIF-1α、RhoA/ROCK、Rac1/PAK和Vimentin对VM的影响。本研究表明HIF-1α和Vimentin在VM+HCC组织中表达上调，而在VM-HCC组织中表达下调。肿瘤组织中HIF-1α和Vimentin高表达患者预后差。乏氧诱导RhoA/ROCK和RAC1/PAK信号转导和EMT。此外，我们还发现ROCK1、ROCK2和PAK在调节Vimentin磷酸化中有不同的作用:RhoA/ROCK和RAC/PAK信号通路调节Vimestin第72位点和56位点的磷酸化在乏氧诱导的VM中起重要作用。