PI3K-RhoA-NFκB通路在血管生成拟态形成中的分子机制研究

Anti-VEGF agents lead to tumor metastasis by increased vasculogenic mimicry, so to elucidate the molecular mechanisms of vasculogenic mimicry will help find a new target for cancer therapy. We have found that short-term administration of anti-angiogenic therapy accelerated vasculogenic mimicry in ovarian cancer animal models, and RhoA was abnormally activated. Inhibition of RhoA could reduce the information of vasculogenic mimicry by inhibition of NFκB. It was reported that PI3K was involved in vasculogenic mimicry and RhoA was regulated by PI3K in tumor metastasis. So PI3K-RhoA-NFκB signalling pathway may exist in the vasculogenic mimicry. The project would observe the role of RhoA in the vasculogenic mimicry to clarify its molecular mechanisms. This project intends to investigate the PI3K-RhoA-NFκB signalling pathway in the vasculogenic mimicry, to explore the multi-target selective intervention treatment of cancer therapy.

抗血管生成药物治疗后肿瘤转移与血管生成拟态形成有关，阐明血管生成拟态的分子机制将有助于找到肿瘤治疗的新靶点。本项目组前期研究发现卵巢癌在接受短期抗血管生成治疗后血管生成拟态增加，RhoA被异常激活，抑制RhoA能减少血管生成拟态形成，这一过程与抑制NFκB激活有关；文献报道PI3K参与血管生成拟态形成，RhoA受PI3K调控。由此推测，血管生成拟态形成过程中可能存在PI3K-RhoA-NFκB信号途径。为证实以上假设，本项目欲采用基因转染调节卵巢癌肿瘤细胞RhoA表达，体内外实验观察其调控血管生成拟态形成；通过寻找磷酸化位点，探讨RhoA如何影响NFκB活性，阐明其分子机制；进一步阻断PI3K，找到调控RhoA的分子或磷酸化位点。最终揭示PI3K-RhoA-NFκB在血管生成拟态中的分子调控机制，探讨多靶点选择性干预治疗肿瘤的可行性，为多靶点治疗肿瘤提供依据。

在肿瘤研究中发现，RhoA/ROCK在多个层次上调控肿瘤的发生发展，新近发现与细胞生存和血管生成有关。而血管化拟态（Vasculogenic Mimicry, VM），是高侵袭性肿瘤通过自身表型和细胞外基质重塑而围成的一种类血管样管道。研究表明VE-cadherin/EphA2/ PI3K / MMP14/MMP2/LAMC2 是 VM 形成的关键通路。另外，EMT被认为是肿瘤发生转移侵袭的起始步骤，而VM的形成也经历了EMT的过程，获得内皮细胞属性而失去间质细胞属性。基于上述研究，本课题首先在比较5种肝癌细胞株与正常肝细胞和人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 三维培养中VM形成能力的研究中发现，MHCC97H肝癌细胞株在24h小时出现VM结构具有形成VM能力，而其他肝癌细胞株不能形成；其次在三维培养条件下比较RhoA/ROCK信号通路表达情况中发现，MHCC97H中RhoA/ROCK信号通路比其他肝癌细胞株显著高表达，提示RhoA/ROCK的高表达易于形成VM结构。在比较不同时间点VM形成情况中发现，RhoA/ROCK的表达随着VM的形成过程而增加（此过程与VE-cadherin变化相同），揭示了RhoA/ROCK的表达与VM的形成具有时效性，提示RhoA/ROCK信号通路参与了VM形成过程。随后我们采用Exoenzyme C3和Y27632在VM形成过程中分别抑制RhoA和ROCK的表达，发现抑制ROCK可以阻止VM的形成，但抑制RhoA却不能，揭示了ROCK在VM形成过程中起到了关键作用；并且在Y27632干预下，我们发现VM关键调控因子VE-cadherin/EphA2/ PI3K / MMP14/MMP2/LAMC2在mRNA和蛋白水平上均显著的降低表达；而在观察EMT过程变化时，表现为内皮性蛋白Vimentin升高而间质性蛋白E-cadherin降低，但在Y27632 的作用下逆转了EMT过程，上述结果揭示了ROCK在VM调控中的潜在机制。最后我们发现ROCK还可以通过阻止肿瘤的侵袭转移来抑制VM的发生。本研究成果揭示了RhoA/ROCK 信号通路参与了VM形成的多个过程，而ROCK是一个潜在的治疗肝癌VM形成的靶点。此部分成果发表于PLoS ONE 9(9): e107661.