活细胞空间特异性生物素标记用于胰岛素囊泡生成、成熟和分泌的分子机制研究

Insulin acts as a key regulator to maintain glucose homeostasis.The secretion of insulin is regulated by the level of plasma glucose via dense core vesicle(DCV). The disorder of the secretion plays a crucial role in the development of type 2 diabetes（T2DM）. So it is necessary to illuminate the molecular mechanism of the DCV biogenesis,maturation and secretion. In this study, we will employ the method relying on a genetically-targetable ascorbate peroxidase 2(APEX2), that biotinylates nearby proteins in live cells, which are subsequently purified and identified by MS. Then we will test the validation of several key proteins by a series of biological methods followed by the functional research. The aims we want to achieve are to clarify that : 1) the insulin biosynthetic interaction network( insulin BIN); 2) the DCV biogenesis pathway; 3)investigate the important proteins which are required in the maturation and secretion of the DCV. Taking advantage of labeling the insulin BIN in living cells, we can tag the proteome of interest with biotin, with all membranes, complexes, and spatial relationships preserved. This proteomic mapping offers us a powerful tool for understanding the molecular composition of insulin BIN , thereby pave the way to elucidate the molecular mechanism of the DCV biogenesis , maturation and secretion.

胰岛素作为调节机体血糖的关键分子，是通过致密核心囊泡（DCV）介导的调节性分泌。胰岛素分泌异常在2型糖尿病发生发展过程中至关重要。因此深入研究DCV生成、成熟和分泌的分子机制具有重要的科学意义，有助于我们了解糖尿病的发生发展机理。本项目拟以胰岛素生物合成相互作用网络为研究对象，在大鼠胰岛β细胞系中，活细胞条件下利用一种过氧化物酶APEX2介导的空间特异性生物素标记和高精度质谱方法检测，结合多种生物学方法验证和生物学功能进行研究，旨在阐明：1）胰岛素生物合成相互作用蛋白网络；2）DCV囊泡的生成途径；3）参与DCV囊泡成熟和分泌过程的关键分子。由于本课题采用活细胞标记，能够尽可能的保持细胞内膜结构、复合物和相对空间关系稳定不变，突破了传统方法对于相互作用蛋白网络研究的局限，因此将得到大量更真实的相互作用蛋白网络数据，为我们深入理解DCV生成、成熟和分泌的分子机制提供帮助。

胰岛素作为唯一降糖激素，其在细胞中的合成、折叠、二硫键生成以及细胞内亚细胞器穿梭是一系列精密的网络。深入研究该过程中的分子网络非常重要。.我们利用APEX2能够在活细胞状态下标记自身20nm附近的蛋白分子的特征，将insulin标记上APEX2酶分子，在不影响其正常细胞定位和功能的情况下，开展活细胞生物素标记。质谱分析标记的蛋白主要定位在ER，ERGIC，Golgi体和穿梭囊泡中。功能上，主要是参与蛋白折叠、二硫键形成、ER转出、Golgi出芽、囊泡组装等。针对关键蛋白，我们开展了细胞定位和细胞敲除实验。针对生物素标记的肽段分析，大量的蛋白介导insulin折叠和二硫键形成，进一步验证了胰岛beta细胞中活跃的合成能力。电镜结果提示，proinsulin在ER中表现为弥散腔内表达，在Golgi内，以膜结合状态存在，支持“entry by selection”假说。.为了增加活细胞标记的特异性，我们开展了互补突变体的筛选，目标是寻找特定环境下具有标记周围蛋白生物素活性的工具，降低非特异的生物素标记。通过大规模的位点突变和截短，成功得到一对互补突变体，用于相互作用蛋白的网络研究。尽管重组后的酶活性不是很高，但是，依然能够用于很多相互作用对分子的研究。其中STIM1和Orai1自身二聚体就是很好的例子。STIM1分别融合互补突变体的两个部分，在活细胞中，共表达融合N端和C端截短突变体，自身二聚体空间近距离能够重组酶活性，催化DAB着色和生物素标记。而Orai1自身二聚体，由于二聚体的C端空间上是互斥的，导致距离增加，破坏了互补突变体的重组，因此，无法催化DAB着色和生物素标记。进一步验证了该工具的高特异性。.未来，我们依然会对质谱鉴定出的分子进行深入的功能研究，尽可能确定胰岛素生物生成的分子调控机制。