利用转录组测序挖掘野生大豆抗斜纹夜蛾相关基因及功能鉴定

Common cutworm is a kind of leaf-feeding insects with worldwide geographic distribution and recently it has become one of the main pests to affect the yield and quality of soybean in China. Species of wild soybean is the original ancestor of the cultivated soybean, which far exceeds that of genetic diversity of the cultivated soybean, and also with a variety of excellent resistance genes. In view of the little mining and utilization of the wild soybean resistance gene of common cutworm, this project aims to use high-throughput transcriptome sequencing technology to detect transcriptional change of the resistant wild resistant soybean and the susceptible cultivated soybean(before and after treatment with common cutworm). Combination of data difference of metabolites associated with insect resistance in resistant and susceptible plant materials，candidate resistance gene was obtained.Through the deep bioinformatics analysis, gene expression profiling analysis and transgenic technology application, insect resistance function of candidate genes were identified and then the regulatory networks of resistance-related gene were constructed for revealing resistance mechanism to common cutworm. Implementation of this project will not only provide new gene resources for plant insect-resistance genetic engineering, moreover, it has great theoretical significance and practical value to mining and utilization of the wild soybean resource.

斜纹夜蛾是一种世界分布极广的食叶性害虫，近年已成为严重危害我国大豆产量和品质的主要害虫之一。野生大豆是栽培大豆的原始祖先种，其遗传多样性远远超过栽培大豆，并且蕴藏着多种优异抗性基因。目前关于野生大豆抗斜纹夜蛾基因挖掘和利用的研究很少，本项目拟利用高通量测序技术，对抗虫野生大豆和感虫栽培大豆（斜纹夜蛾啃食处理前、后）进行转录组测序，系统研究抗性野生大豆和感性栽培大豆基因表达谱差异。结合抗感材料抗虫相关代谢物差异的测定，获得抗斜纹夜蛾候选基因。通过生物信息学分析、基因表达谱分析和转基因技术对抗虫候选基因进行功能验证，最终挖掘野生大豆抗斜纹夜蛾相关基因，构建相关基因的调控网络，揭示野生大豆抗斜纹夜蛾的分子机制。本项目的完成不仅将大豆抗虫分子育种提供了新的基因资源，同时对野生大豆资源的挖掘和利用具有重要理论意义和实践价值。

野生大豆比栽培大豆具有更高的遗传多样性，然而关于野生大豆基因抗斜纹资源的研究仅处于初级阶段。前期研究获得野生大豆对斜纹夜蛾的高抗材料和栽培大豆高感材料，本研究利用转录组测序技术对野生大豆抗虫相关基因进行挖掘。.利用斜纹夜蛾对抗虫野生和感虫栽培大豆材料进行啃食诱导处理，于接虫后2 h、4 h和12 h进行混合取样，进行RNA-seq测序和代谢组学研究。通过K-means聚类分析对差异表达基因进行趋势分析，获得9个经斜纹夜蛾诱导在野生大豆中表达显著上调趋势，而在栽培大豆中表达变化不显著或下降的基因。对差异表达基因进行GO功能分析和KEGG通路富集分析，发现差异基因主要富集于谷氨酸代谢（glutamate metabolism）、基础转录因子（basal transcription factor）两个代谢途径。.对衍生化后的栽培大豆和野生大豆叶片提取物进行GC−TOF/MS分析。在抗虫野生大豆中显著增加的差异代谢物均属于次生物质，有酚类物质、非蛋白氨基酸代谢产物、烷类物质，酯类物质、含氮化合物，甾类激素。整合转录组和代谢组分析结果，将谷氨酸脱羧酶基因（glutamate decarboxylase，GAD）和锌指蛋白转录因子基因（TGA）作为野生大豆抗斜纹夜蛾的重要候选基因。.克隆了野生大豆的GsGAD和GsTGA基因，二者均分布于11号染色体上。GsGAD的 ORF区长1512bp，编码503个氨基酸，分子量为57.11Kda，为跨膜蛋白。1到71个氨基酸为跨膜结构域，从33到385个氨基酸是蛋白质的保守结构域。GsTGA的ORF区长1050bp，编码349个氨基酸，分子量为39.53 Kda，具有锌指蛋白转录因子特有的保守区。.荧光定量PCR结果显示GsGAD在根中优势表达，在茎中表达最弱。GsTGA基因在叶中表达表达量最高，在其它组织中表达相对较低。在高盐胁迫下，GsGAD基因受到诱导，表达呈现显著上升后下降趋势，GsTGA基因表达没有显著变化；在干旱胁迫下，GsTGA表达量显著上调后下降，而GsGAD基因表达没有显著变化。.构建了含GsGAD和GsTGA基因的植物过表达双元载体，利用转基因技术获得转基因烟草。在饲喂斜纹夜蛾试验中，过表达GsGAD的转基因烟草叶片损失与野生型烟草相比明显较少，取食过表达GsGAD转基因烟草叶片的斜纹夜蛾相对生长率明显下降。本研究为大