奶牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白多亚单位融合抗原的构建及B细胞表位免疫特性研究

The surface proteins sip, pgk and fbsA of dairy cow mastitis Streptococcus agalactiea play an important role in virulence, and are also the important candidated protective antigen. Monovalent surface antigen showed a certain degree of immunogenicity, however,the immune protective effect of the multivalent fusion antigen to dairy cows is nuclear. In prospective study, we have found that the immune effect of the bivalentvalent antigens were better than monovalent antigen. Accordingly, we proposed to construct multi-subunit surface fusion antigens and to study the immune characteristics in dairy cows. We will clone the extracellular coding sequences of the three genes by the PCR technic and will construct the fusion genes fps by repeat PCR. The fusion genes fps will be inserted into expression vector pET，and after will be identifyed and squenced to be transfered into enginereing E. coli BL21 and to be induced and expressed. The expressed FPS fusion protein will be purified. After the vitro climb-chip antibody blocking experiment and subcellular location test will be finished, the immunization experiments in dairy cow will be implemented with the purified fusion antigens. The objective of this study will to explore the immune protective effect and the antibodies law and which will have an important scientific significances for to estimate the immune mechanism of the sip, pgk and fbsA multi-subunit fusion antigens in dairy cow. This study will provide a new thinking for further study the prevention and control ways and new immune agents of dairy cow mastitis.

牛乳腺炎无乳链球菌sip、pgk、fbsA表面蛋白在致病过程中起到关键作用,是该致病菌重要的免疫靶标蛋白,单价抗原表现一定的反应原性,但是其多亚单位融合抗原对奶牛的免疫保护效果尚不清楚。我们在前期工作中发现双价亚单位（sip、pgk）抗原的免疫效果优于单价抗原,据此提出构建多亚单位融合抗原免疫奶牛进行免疫特性研究的设想。我们将用PCR技术从该致病菌总DNA分别扩增出上述3个基因细胞外编码序列，利用重叠PCR技术构建融合基因fps,克隆至原核表达载体pET中,经鉴定及序列分析转化至工程菌BL21后诱导表达,纯化fbs融合蛋白,经体外MDBK细胞爬片抗体阻断实验,完成亚细胞定位后进行对科尔沁奶牛的免疫特性研究。探索其免疫保护效果及抗体产生规律,对阐明该致病菌表面蛋白多亚单位sip、pgk、fbsA融合抗原对科尔沁奶牛的免疫机制具有重要科学意义,为进一步研究其防控途径及新型免疫抗原提供新的思路。

本项目以科尔沁奶牛乳腺炎无乳链球菌为研究对象，开展该致病菌重要表面抗原蛋白SIP、PGK、FBSA多亚单位融合蛋白的抗原性研究。主要完成了科尔沁奶牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白SIP、PGK、FBSA基因克隆、序列分析及潜在的抗原性预测，科尔沁奶牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白SIP、PGK、FBSA多亚单位抗原对实验动物的免疫活性研究，并以rSIP-PGK-FBSA融合抗原作为检测抗原建立了检测多亚单位免疫抗体滴度的间接ELISA方法。为了鉴定表达、获得多亚基融合抗原的表面定位信息，通过利用无乳链球菌全菌体免疫抗体作为一抗的间接ELISA方法，间接对表达获得的rSIP-PGK-FBSA蛋白进行了菌体表面定位，最终采用rSIP-PGK-FBSA多亚单位融合抗原免疫科尔沁奶牛进行免疫保护研究等工作。项目研究成果达到了预期目标，完成了项目计划研究内容。主要研究结论：SIP、PGK、FBSA亚单位蛋白位于牛乳腺炎无乳链球菌的菌体表面，属于表面抗原，并且具有良好的抗原性，尤其在三种抗原融合表达产物rSIP-PGK-FBSA免疫奶牛保护性试验时，其免疫保护效果比起原先各自独立免疫的效果具有增强现象。即rSIP-PGK-FBSA多单位融合抗原的免疫保护率达到91.6%，而SIP+PGK、全菌体裂解抗原免疫组免疫保护率分别为75.0%、58.3%，免疫保护率差异显著，差异具有统计学意义。统计分析结果表明，第1组抗原免疫保护率与第2、3组间免疫保护效果的差异值分别为tc=2.090、tc=3.922，其免疫保护效果优于SIP+PGK、全菌体裂解抗原免疫组。. 研究成果科学意义：国内外首次探索出牛乳腺炎无乳链球菌表面多亚单位rSIP-PGK-FBSA具有良好的抗原性，而且融合抗原具有更好的免疫保护效果的科学依据。为有效防控关系人类健康与乳源安全的牛乳腺炎提供了新的防控理论及实验依据，为研发新型、安全的基因工程重组疫苗及检测试剂奠定了坚实的基础。