牛乳腺炎无乳链球菌sip及pgk基因B细胞表位蛋白的免疫特性研究

本项目以患乳腺炎奶牛乳中分离的无乳链球菌总DNA为模板，扩增出其sip（表面免疫相关蛋白）及pgk（磷酸激酶）基因，并对其分别进行克隆、高效表达、亲和层析纯化后，经western blot鉴定其免疫反应性；免疫小鼠探索其抗原性，同时制备单克隆抗体；进一步建立以无乳链球菌原生质体为包被抗原的ELISA，对sip及pgk表达蛋白进行亚细胞定位；通过小白鼠做模型进行免疫抗体的调理吞噬试验，再以奶牛为实验对象进一步探索其免疫特性。本项目的创新之处在于克服了国外同行只将人源无乳链球菌的表面蛋白基因进行表达后用小鼠验证了其免疫保护活性，而没有在人或奶牛上进行免疫特性验证的不足。探索牛乳腺炎无乳链球菌内蒙古分离株主要菌体蛋白对奶牛分别免疫和联合免疫的免疫保护特性，并进行外周血抗体效价检测，对于科学评价和筛选sip及pgk候选抗原提供有价值的科学依据，同时为下一步进行相关应用基础研究奠定实验基础。

本项目以科尔沁奶牛乳腺炎无乳链球菌为研究对象，开展该致病菌重要表面抗原蛋白sip、pgk亚单位蛋白的抗原性研究。主要完成了科尔沁奶牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白sip、pgk基因克隆、序列分析及潜在的抗原性预测，科尔沁奶牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白sip、pgk亚单位抗原对实验动物的免疫活性研究，建立了检测免疫抗体滴度的间接ELISA方法，通过利用无乳链球菌全菌体免疫抗体作为一抗的间接ELISA方法，间接对表达获得的sip、pgk蛋白进行了菌体表面定位，最终采用sip及pgk两个亚单位抗原混合免疫及各自独立免疫的策略对科尔沁奶牛进行免疫保护研究等工作，项目研究成果达到了预期目标，完成了项目计划研究内容。主要研究结论：sip及pgk蛋白位于牛乳腺炎无乳链球菌的菌体表面，属于表面抗原，并且具有良好的抗原性，尤其在两种抗原混合免疫时，其免疫保护效果比起各自独立免疫的效果具有增强现象。即SIP+PGK混合抗原的免疫保护率达到83.3%，而SIP、PGK亚单位抗原单独免疫组的免疫保护率分别为33.3%、41.6%，经过生物统计学处理结果为SIP+PGK混合抗原免疫组的免疫保护率比起SIP、PGK抗原单独免疫组的免疫保护率差异显著（p<0.05），具体差异显著值分别为tc=2.0800、2.0690。结果优于上述两种亚单位抗原各自独立免疫的免疫保护效果。探明了牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白抗原sip、pgk具有抗原性，而且在其两者混合免疫情况下具有更好的免疫保护效果的科学依据。