Rho/Rho激酶在EAE发病机制中的免疫调节作用研究

Rho/Rho 激酶（Rock）调控多种细胞的增殖、移行。新近发现神经系统病理状态均有Rho/Rock 的活化。我们前期应用Rock抑制剂Fasudil治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型，观察脾脏、脑、脊髓中Rock的表达，证实通过阻断Rock的活化，可改善EAE发病。本研究拟采用RT-PCR、Western blot、流式细胞术、细胞培养、电镜观察、免疫组化等方法在mRNA、蛋白水平全面阐明Rock在EAE小鼠外周和中枢神经系统（CNS）免疫细胞、血-脑屏障（BBB）的表达图谱和激活情况。应用Fasudil治疗EAE，研究Rock激活对外周免疫细胞向CNS移行、BBB功能障碍和CNS免疫细胞趋化作用的细胞分子机理，探讨Rho/Rock的活化对EAE发生、发展的作用途径，明确Faudil治疗EAE的作用靶点和细胞分子基础，为临床应用Rock抑制剂治疗多发性硬化提供实验依据。

MS是以CNS白质炎性脱髓鞘病变为特症的自身免疫疾病，Rho/Rho激酶（ROCK）是机体普遍存在的一条信号转导通路。本课题以MS的经典动物模型EAE为研究对象，应用ROCK抑制剂Fasudil探讨ROCK在EAE发生、发展中的意义，明确Fasudil治疗EAE的作用机制。体内实验结果显示，Fasudil推迟EAE起病，减轻临床症状，改善脱髓鞘，减少CNS炎性细胞浸润；诱导脾脏调节性T细胞的分化，并抑制Th17细胞的产生；降低巨噬细胞M1亚型CD16/32、iNOS、IL-12、TLR4、CD11c、CD40水平，促进M2亚型CD206、Arg-1、IL-10、CD14、CD23表达；抑制中枢M1亚型iNOS表达；增强M2亚型Arg-1表达，抑制脾脏细胞炎性细胞因子IL-17、IL-1β、TNF-α、MCP-1释放，并增强保护/抑制性细胞因子IL-10分泌；抑制中枢TLR-4、p-NF-κB/p65或AP-1的炎性信号通路和炎性细胞因子IL-1b、IL-6、TNF-a水平，诱导具有神经保护作用的CB2R表达；减少中枢伊文思蓝含量，维持BBB完整性，增强内皮细胞紧密连接蛋白occudin、ZO-1表达。体外实验结果显示，Fasudil抑制LPS诱导的星形胶质细胞趋化因子MIP-1α、RANTES、CCL20和MCP-1表达，从而减少其对T细胞的趋化作用；减少星型胶质细胞NO产生和IL-6、TNF-α释放；使小胶质细胞iNOS、IL-12表达减弱，Arg-1、IL-10、CD23表达增强；抑制小胶质细胞p-NF-κB/p65激活，NO产生和IL-1、IL-6、TNF-α释放，增强IL-10分泌。被动转移实验进一步探讨Fasudil治疗EAE细胞分子基础，获得了与体内实验类似的结果。Fasudil处理的致炎性MNCs不能通过被动转移介导EAE，并抑制脊髓TLR-4/p-NF-kB/p65表达。上述结果证实Rho/ROCK信号通路的激活在EAE发病中起重要作用，Rho激酶抑制剂Fasudil显示了治疗EAE的潜能，与巨噬细胞/小胶质细胞由致炎的M1型转化为抗炎和修复的M2型，降低Th1、Th17细胞因子分泌，促进Th2细胞表达，抑制TLR-4/NF-kB信号通路，下调星形胶质细胞趋化因子表达，维持BBB完整性，减少外周免疫细胞的中枢迁移及CNS有害物质的释放密切相关。