补阳还五汤干预EAE气滞血瘀证神经保护的多位点作用研究

Clinical studies have shown that Buyang Huanwu decoction had a therapeutic effect in ameoliorating the severity of multiple sclerosis(MS), reducing the number of relapses. Modern pharmacological studies reveal some active ingredients of Buyang Huanwu decoction exerts neuroprotective effects by decreasing inflammatory cells and inflammatory cytokines,inhibiting the damage of free radical. Rho-kinase (ROCK),a serine/threonine kinase,is activated in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The blockade of Rho/ROCK is considered to be beneficial to achieving neuroprotection, axonal regeneration, oligodendrocyte generation, and suppressing inflammatory responses. Thus, targeting ROCK inhibition is a promising strategy to treat central nervous system (CNS) disease. We induced a chronic- progressive EAE with Qi Deficiency and Blood Stable Syndrome in B6 mice immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55 and intervent it with Buyang Huanwu decoction in early and late stages of the disease. The goal of this investigation is to further explore the efficacy of peripheral and CNS immunomodulatory and inflammatory responses, includig regulation of T cell subsets, polarization of macrophage subsets, investigate the integrity of blood brain barrier(BBB)and regeneration. We try to expore the expression and activation of ROCK/ TLR-4/ NF-κB, attempt to pay close attention to multi-targets for the neuroprotection and neuroregeneration of MS/EAE. These studies will expand the therapeutic strategies of Yiqihuoxue Method for treatment of MS/EAE.

临床研究表明，补阳还五汤能有效缓解MS病情，减少发作次数与发作程度。现代药理发现，补阳还五汤中的部分药物及有效成分可以选择性地降低炎性细胞因子含量，减轻自由基损伤，增加MS动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）炎性细胞凋亡，减轻神经组织损伤，从而保护神经细胞。Rho/Rho激酶（ROCK）信号通路的激活与MS/EAE的发生、发展密切相关，抑制ROCK信号通路的激活已成为神经系统炎性变性疾病很有希望的治疗策略。因此，本研究拟在免疫后诱导期（第3天）和免疫后发病期（第14天），给予补阳还五汤干预，观察补阳还五汤治疗EAE气滞血瘀证的临床评分、髓鞘修复能力、外周和中枢免疫调节效应、血脑屏障（BBB）的完整性及神经再生等神经保护作用的效果，以及调控ROCK/TLR4/NF-κB的细胞分子机制，阐明中药复方治疗MS的靶点与途径，对指导临床运用益气活血法有效防治MS有重要的理论意义和实用价值。

多发性硬化（MS）是炎性自身免疫性疾病,气虚血瘀证是MS中医辩证论治中常见证型之一,临床研究表明益气活血法的代表方剂补阳还五汤（BYHWD）能缓解 MS 病情。Rho/Rho 激酶（ROCK）信号通路的激活与 MS/实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发生、发展密切相关。因此，我们观察了BYHWD、黄芪糖蛋白（HQGP）、黄芪甲苷（AST-IV）治疗 EAE的疗效并探讨其是否与抑制 ROCK 信号通路的激活有关。结果显示，BYHWD、HQGP、AST-IV可推迟EAE起病，减轻临床症状，改善脱髓鞘，减少CNS炎性细胞浸润。BYHWD可以下调炎性T细胞CD4+IL17+、巨噬细胞CD11b+IL-12+、CD11b+CD16/32+的表达，上调抗炎性细胞CD4+CD25+、CD4+IL-10+、CD4+TGF-β+、CD4+IFN-γ+的表达；抑制外周炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的释放。BYHWD可显著抑制EAE小鼠iNOS、TNF-α的表达，同时促进Arg-1、IL-10的表达，使脾脏和脊髓组织中M1型细胞转化为M2型。BYHWD抑制EAE小鼠脊髓神经元损伤，与EAE对照组相比，BYHWD组NeuN阳性表达面积明显增加，轴突组织学形态较完整，轴突更长，MAP-2阳性表达面积显著增加。BYHWD可通过促进BDNF、GDNF等NTFs等的表达；降低神经抑制因子的表达，调节神经生长的微环境，发挥神经保护的作用。BYHWD可维持血脑屏障（BBB）的完整性，增强内皮细胞紧密连接蛋白Occudin、ZO-1表达。BYHWD组可抑制脊髓ROCKⅡ、TLR4、Myd88、p-NF-κB/p65、COX-2的表达。HQGP可通过减少趋化因子的分泌和细胞粘附，抑制神经炎症；保护小鼠脊髓轴突的完整性，起到神经保护作用。体外实验表明AST-IV可促进小胶质细胞向M2表型极化，保护神经元免受小胶质细胞介导的细胞损伤；可通过抑制 TLR4 的表达改善星形胶质细胞的激活；对TLR-4-MyD88信号具有抑制作用。黄芪注射液可促进脾M1型转化为M2型，使抗炎性细胞因子IL-10和IL-4分泌增加。研究表明BYHWD及其黄芪有效成分具有治疗EAE的潜能，其疗效可能与抑制 ROCK 的表达和激活及其下游的 TLR4/NF-κB，从而改善炎症微环境、调节免疫、促进髓鞘修复及神经再生有关。