桑黄(P.igniarius)黄酮生物合成机制及定向代谢调控研究

黄酮是一类具有多种生理活性功能的天然化合物。在目前唯一已知可以合成黄酮的高等真菌桑黄中，其黄酮代谢合成途径及调控机理尚不十分清楚。本研究拟构建桑黄可转化人工染色体基因组文库，利用杂交筛选方法，克隆黄酮合成基因簇，并用生物信息学方法分析黄酮合成基因簇序列和推测开放阅读框功能，解析从苯丙氨酸合成黄酮的生物机制。同时，根据植物黄酮合成途径，克隆并鉴定桑黄黄酮合成途径可能的两个关键酶基因：查耳酮合成酶(CHS)和黄酮合成酶(FNS)，根据微生物代谢中体现出的"生物平衡性与经济性原则"，利用代谢酶空间组织工程原理，借助蛋白之间特定相互作用而形成的支架结构，设计CHS和FNS酶与其临近代谢酶的多酶复合体，使其按照优化比例表达，从而模拟天然存在的底物沟道传递与加工机制，期望在维持代谢酶较低表达水平下，实现对酶催化效率的改善，调控黄酮定向超量合成。这将为食药用菌活性物质代谢调控研究奠定理论基础。

项目的背景：黄酮是一类具有多种生理活性功能的天然化合物。高等真菌桑黄可以合成黄酮，但是黄酮代谢合成途径及调控机理目前尚不清楚。.主要研究内容：本研究利用全基因组测序技术，解析了桑黄从苯丙氨酸合成黄酮的生物机制。同时，克隆黄酮合成途径的关键酶基因，利用代谢酶空间组织工程原理，借助蛋白之间特定相互作用而形成的支架结构，设计关键酶与其临近代谢酶的多酶复合体，使其按照优化比例表达，期望在维持代谢酶较低表达水平下，实现对酶催化效率的改善，调控黄酮定向超量合成。.重要结果与关键数据：.（1）桑黄全基因组测序：运用Illumina HiSeq 2000高通量测序平台对桑黄全基因组进行了序列测定，结果发现桑黄全基因组的大小大约为33.3 Mb，9169个基因编码序列，GC含量平均为51.2%。同时对基因组序列进行了数据质量评估、拼装组装、编码基因预测以及基因功能注释和比较基因组学分析。结果表明，共有5064个基因注释上GO功能分类，样本基因的功能主要聚集于cellular process和metabiolic process；共有3074个Unigene被注释上25种KOG分类；共注释到302条KEGG代谢通路。.（2）黄酮生物合成途径：利用生物信息学软件和在线工具对PAL，C4H，4CL，CHS, CHI和FNS基因序列进行了拼接，获得了桑黄从苯丙氨酸合成黄酮的整个基因簇结构；初步明确了黄酮化合物的生物合成途径；.（3）功能性多酶复合体的构建：利用PCR技术或者化学合成技术获得了黄酮合成途径相关酶的编码基因（PAL，C4H，4CL，CHS, CHI和FNS），设计出了能够识别代谢酶的结构域及配体，组建了支架结构，并构建了蛋白支架表达载体pJD141；同时设计出了融合配体的多酶复合体的基因簇；.（4）黄酮高产菌的构建：将多酶复合体的基因簇导入桑黄，构建了可用于工业发酵的黄酮高产菌株1株；.（5）目前已发表SCI论文9篇，授权专利2项，培养研究生5名。.科学意义：本项目有机地融合基因工程、蛋白质工程和代谢工程的技术与方法，深入揭示了桑黄黄酮次生代谢的分子机制及生物合成中各代谢中间产物的化学计量关系，为黄酮合成基因的定向遗传改造、构建高效稳产菌株及提高黄酮代谢水平提供了依据。同时，研究结果将为建立具有良好普适性的真菌代谢工程新方法提供借鉴。