GDNF基因修饰的的羊水干细胞干预肾间质纤维化的机制研究

Chronic hypoxia and tubulointerstitial injury is a major cause of renal interstitial fibrosis, and peritubular capillary (PTC) injury plays a critical role in renal hypoxia and tubulointerstitial injury. In our previous study, we found PTC injury was the important causes of several models of nephropathy; however, amniotic fluid derived stem cells (AFS) transplantation ameliorated PTC injury and hypoxia, and alleviated the progression of renal interstitial fibrosis. On the basis of previous studies, our project will focus on the protective mechanisms of glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) gene modified AFS(GDNF-AFS) on renal interstitial fibrosis in a murine model of unilateral ureteral obstruction (UUO). We will investigate the signal pathway of hypoxia-mediated renal interstitial fibrosis by examining the MAPKs pathway. We will observe the effect of GDNF-AFS on the differentiation of the endothelial-like cells and tubular epithelial cells by in vitro experiments. We will examine the effect of GDNF-AFS transplantation on angiogenesis and the restoration of tubular epithelial cells and investigate the mechanisms and the role of GDNF-AFS on the development of renal interstitial fibrosis. These results will provide insights on GDNF-AFS as a new cell source for the clinical treatment of renal fibrosis.

慢性缺氧和小管间质性损伤是引起肾间质纤维化的主要因素，而肾小管周围毛细血管（PTC)损伤是引起肾脏缺氧和小管间质损伤的重要原因。申请者前期研究发现PTC损伤可以引起多种肾病模型肾间质纤维化，羊水干细胞 (AFS)干预可以改善PTC损伤和继发低氧，减轻肾间质纤维化程度。本项目拟在原有研究特色的基础上，应用单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型，在整体、细胞和分子水平研究，重点探索胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰的AFS(GDNF-AFS)改善肾间质纤维化的机制。通过MAPKs通路蛋白的检测，了解低氧介导肾间质纤维化的信号通路。通过体外实验，观察GDNF-AFS向血管内皮样细胞和肾小管上皮细胞分化的能力。通过观察肾脏移植GDNF-AFS对UUO小鼠模型血管新生的影响和肾小管损伤的修复情况，研究GDNF-AFS干预肾间质纤维化的机制及可行性，为临床治疗肾脏纤维化提供新的思路。

研究证实，肾间质纤维化程度与肾功能减退的相关性，比肾小球硬化与肾功能减退的相关性更为密切，且成为肾小球疾病中的“相对独立事件”。因此，积极探索导致肾间质纤维化的分子机制以及有效防治措施，有着极其重要的医学价值和社会意义。.研究表明，慢性缺氧和小管间质性损伤是引起纤维化的主要因素，而肾小管周围毛细血管损伤是引起肾脏缺氧和小管间质损伤的重要原因。事实上，肾脏微血管不仅是炎症、代谢等损害因素的承受者，也是肾脏损伤的直接参与者，维持微血管功能与数目是预防肾脏病变持续进展的关键。.我们主要以下几个方面进行研究：1.羊水干细胞（AFS）的培养、鉴定；2. GDNF重组病毒载体的制备；3. GDNF-AFS生物学特性检测，GDNF-AFS分化为血管内皮样细胞和肾小管上皮细胞的能力；4. AFS、GDNF-AFS干预肾间质纤维化的作用及机制。.我们的研究发现：.1.低氧可以促进P38 MAPK活化，促进CTGF、TGFβ和CollagenⅠ表达增加，肾间质纤维化加重，P38抑制剂可以减少p-p38/p38比值，减少CTGF的表达，从而减轻肾间质纤维化。此项研究揭示了低氧导致肾间质纤维化的信号通路。.2.小鼠UUO 模型微血管损伤继发低氧，从而导致肾脏纤维化加重。AFS体外培养后通过尾静脉注入小鼠体内，可以改善肾脏微血管损伤和低氧，从而减轻肾脏纤维化。此项研究在国际上首次报道了AFS可以治疗肾间质纤维化。.3.GDNF可以成功转染AFS，转染后的AFS稳定表达GDNF。和VEGF一起培养时，表达vWF和CD31，且GDNF-AFS的作用优于AFS。此项研究表明AFS可以促进血管新生，GDNF基因治疗可以增强AFS的促血管新生作用。.4.AFS可以成脂、成骨分化。缺氧复氧处理后小鼠肾小管上皮细胞（mRTECs）凋亡增加，AFS和mRTECs共培养后CK18、E-cadherin表达增加，GDNF-AFS的作用优于AFS。此项研究表明AFS可向肾小管上皮细胞分化，GDNF可以增强其作用。.5.UUO小鼠模型氧化应激、炎症指标表达增加，继而引起VEGF表达减少，肾脏微血管密度下降、低氧增加、纤维化加重。AFS干预可减轻氧化应激、炎症，改善肾脏微血管损伤、低氧和线粒体损伤，减轻肾脏纤维化。GDNF-AFS干预效果优于AFS。此项研究表明GDNF可以增强AFS治疗肾间质纤维化的作用。