基于Rep-RBE高效位点特异性整合的基因治疗系统研究

基因治疗可能是遗传病主要或唯一的希望，但其安全性和有效性却一直困扰着该领域的发展。本课题以B型血友病为研究对象，利用我们在先前的探索性研究中发现的具有单一位点整合功能的Rep-RBE核心元件建立的位点特异性整合转基因体系,检测评估携有hFIX的载体在模型动物体内的动力学特征，揭示携有hFIX目的基因的质粒的分布、转录、翻译、毒性、免疫反应等一系列的动力学过程和在主要分布器官中的位点特异性整合情况，并根据实验结果在安全性和有效性方面对该系统进行进一步优化和改造。通过此项研究，有望建立一种既可以减少病毒性载体的随机插入的潜在性危险以及因为免疫因素无法多次使用的限制，又可以克服质粒载体不能使外源基因长期、稳定、有效地表达的缺点的新的基因治疗方法，并为该系统最终在基因缺陷性疾病治疗和有安全性需求的转基因操作中的运用提供理论贮备和技术支持。

我们以B型血友病为研究对象，利用我们在先前的探索性研究中发现的具有单一位点整合功能的Rep-RBE核心元件，构建了一个由肝特异性定位元件（以下简写为h）、肝特异性启动子（HP）和位点特异性元件（RBE）组成的具有位点特异性整合功能的新的位点特异性转基因质粒系统（pRBE-h-HP-hFIX等），在体外将此质粒与Rep蛋白表达质粒共转染HEK293, A549, HepG2, L02 细胞，体内则将前述两种质粒以高压尾静脉快冲的方式注射入转有人AAVS1基因的小鼠体内，结果显示：体外实验中，不同来源的细胞间比较，hFIX表达水平在HepG2和L02细胞中高于A549和HEK293；在转染的四种细胞中，同组比较，pRBE-HCR-hAAT-hFIX的hFIX表达量比pRBE-CMV-hFIX高，但其间并无显著差异；然而，在转基因动物体内，该质粒携带的目的基因的表达水平却更高，而且持续时间更长，给药后的240天检测仍然可达正常人水平的1%以上，显示出一定的临床应用前景；体内AAVS1区域的位点特异性整合同时也被检测到。与此同时，与质粒注射相关的肝脏毒性和由于目的基因表达产物导致的免疫原性也呈现出一过性的，短暂的，可逆的变化，显示出该给药系统能满足基因治疗中的安全性的要求，但其目的基因的表达水平仍有待进一步提高。该质粒系统给药后在肝、心、肺、脾、肾等主要器官、组织中均有分布和表达，但以肝和心为最多。相关的研究成果已整理成文并且投出，其中，一篇综述已经发表，一篇论文已被接收，即将付刊；一篇论文正处于修改阶段，此外，还就此项目申请了一项专利。围绕着此项目开展，培养了三名研究生，其中，两名已经毕业。