黄瓜苦味物质葫芦素C生物合成途径及关键酶基因CMOG1的功能研究

As one of the most important vegetables, Cucumber attracts much attention. Triterpene constituent Cucurbitacin C, which is the bitter principle in cucumber, seriously affects the taste of cucumber. To solve the bitter problem fundamentally, a thorough research on the molecular mechanism of Cucurbitacin C synthesis is necessary. Based on the genome mutation group, transcriptomics, metabolomics analysis, molecular biology and genetics analysis, we have cloned the key gene Bi and predicted another eight candidate genes involved in the biosynthesis of Cucurbitacin C, where Bi gene played the role of encoding cyclase to catalyze the first key step reaction. On this basis, this project intends to elucidate the second step reaction of the biosynthesis and the function of monooxygenase gene CMOG1 involved by means of yeast expression systems and gene silencing technology. Meanwhile, a phytochemical investigation on the leaves of Cucumis sativus L. is being undertaken in order to isolate and identify the cucurbitane type intermediates formed during Cucurbitacin C biosynthesis, which might in turn reveal the biosynthetic pathway by analyzing the structural characteristic of them. As is described, this project characterizes the synthetic pathway of Cucurbitacin C in cucumber, which provides a scientific evidence for cucumber molecular breeding. In addition, to clarify the biosynthesis molecular mechanism of Cucurbitacin C also provides a reference for the biosynthetic research on other triterpenoids; and lays a solid foundation for the development of new bio-pesticide from Cucurbitacin C.

黄瓜作为我国最重要的蔬菜之一，它的品质受到诸多的关注。三萜类物质葫芦素C为黄瓜中的主要苦味成分，严重影响着黄瓜的口感。为了从根本上解决黄瓜苦味问题，必须对葫芦素C合成的分子机制进行研究。前期我们通过整合基因组、变异组、转录组、代谢组、分子生物学及遗传学知识克隆了葫芦素C生物合成的关键基因Bi并预测了其它8个参与合成的候选基因；其中Bi基因编码环化酶催化葫芦素C生物合成的第一步关键反应。在此基础上，本项目拟用酵母表达体系和基因沉默技术对参与葫芦素C合成第二步反应的单加氧酶基因（CMOG1）的功能进行分析，同时，通过分离纯化黄瓜叶中葫芦素C合成中间体并鉴定结构，从生源关系角度对葫芦素C的合成途径进行解析。本项目研究解析黄瓜葫芦素C的合成通路，为黄瓜分子育种提供科学依据。此外，葫芦素C生物合成分子机制的阐明还为其它三萜的合成生物学研究提供了参考，为将葫芦素C开发成新型生物农药打下坚实的基础。

葫芦科植物黄瓜、甜瓜、西瓜等是我国重要的蔬菜及水果。在种植过程中，高温、干旱或虫害等因素作用会导致它们的果实变苦。这种苦味是由一类叫葫芦素的四环三萜化学成分导致的。一方面，葫芦素在果实中积累，使得果实变苦，影响商品品质；但另一方面，葫芦素在叶或根中积累，能够抵抗病菌，防御虫害的侵袭。现代药理研究表明，葫芦素在抗肿瘤上具有很好的药用潜力，但它们在植物体内含量相对较低，化学合成难度大，影响了它们的开发利用。为了解决上述问题，本课题运用基因组、转录组、靶向代谢等多重组学和技术对葫芦素开展合成生物学研究，取得了以下研究结果。. 在对黄瓜植物体内的葫芦素代谢产物研究中，我们运用现代色谱和波谱技术，从375 kg新鲜黄瓜叶中分离并鉴定了16个葫芦素类型化合物（化合物1-16）其中，化合物2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、14、15、16为新化合物。从生源途径来看，化合物5、8、14可能是葫芦素生物合成路径的中间产物。. 在黄瓜、甜瓜、西瓜的基因组、转录组和变异组基础上深入挖掘数据，并结合遗传学、分子生物学等多种研究手段，分别揭示了葫芦素C、B、E的合成基因簇，它们具有很强的保守性，但同时存在进化差异。运用质谱分析、核磁共振等代谢分析技术，我们成功验证了三个基因簇中氧化角鲨烯环化酶基因（CsBi/CmBi/ClBi）、4个P450基因（Cs540、Cs160/Cm160/Cl160、Cs890/Cm890/Cl890、Cm180/Cl180）、乙酰转移酶基因（Cs700/Cm700/Cl700）的功能。其中，保守P450基因890是多功能基因，编码的蛋白能催化多步氧化反应；差异P450基因540和180，分别在C19位和C2位催化羟基化反应，导致了葫芦素C和葫芦素B、E的结构差异。. 本研究首次揭示了葫芦科植物次生代谢产物葫芦素形成过程中，保守基因催化保守位点、差异基因催化差异位点这一分子机制，这对于研究其它植物的次生代谢具有非常重要的参考意义。此外，葫芦素B、C、E合成基因路径的破解也为开发抗癌新药打下了坚实的基础。