布鲁氏菌毒力相关sRNAs的鉴定及相关机制的研究

The bacteria sRNAs play important roles in various biological pathways, and sRNAs are also related to bacterial virulence in some pathogenic bacteria. As the pathogens of human and animal brucellosis, studies of their pathogenesis have great significance for guiding the prevention and control of brucellosis. However, research on Brucella sRNAs is very limited. Previous studies of our team have predicted putative sRNAs and the functions of several sRNAs were also studied. To study the virulence-related mechanism of sRNAs in Brucella, we propose to verify the prediction results of sRNAs using RT-PCR，and study the targets of verified sRNAs by bioinformatics method and two-plasmid system. Then mutants of sRNAs will be constructed and used to detect the virulence-related sRNAs by evaluating their survival abilities in both macrophages and mice infection models. To explain the virulence related mechanism, stress response assays will be performed, and the expression levels of corresponding targets and virulence genes also will be detected. This study will provide information about sRNAs related pathogenesis and development of new drugs for Brucella.

细菌的sRNAs在多种生物学途径中发挥着重要作用，在某些致病菌中sRNAs还与细菌的毒力密切相关。布鲁氏菌作为引起人和动物布病的病原体，其致病机制的研究对于指导布鲁氏菌病的防治具有重要意义。在布鲁氏菌中sRNAs的研究非常有限。申请人早期的研究工作对布鲁氏菌的sRNAs进行了预测，并对少数sRNAs的功能进行了研究。为了研究布鲁氏菌sRNAs毒力相关机制，拟采用反转录PCR对预测sRNAs结果进行验证，通过生物信息学预测和双质粒系统验证对sRNAs的靶点进行研究。对鉴定出的sRNAs构建相应的突变株，并通过感染巨噬细胞和小鼠筛选毒力相关sRNAs，利用环境应激实验和检测靶点基因、重要毒力因子的表达水平解释sRNAs突变株毒力降低的机制。本研究为探索布鲁氏菌中sRNAs参与的致病机制和筛选治疗所需靶标奠定基础。

细菌的sRNA在多种生物学途径中发挥着重要作用，在某些致病菌中sRNA还与细菌的毒力密切相关。在前期研究工作中，对布鲁氏菌的sRNA进行了预测，并对少数sRNA的功能进行了研究。本研究中，采用反转录PCR对前期sRNA的预测结果进行了验证，共验证出50个sRNA。这些经过验证的sRNA长度主要分布于1-299 nt的范围内。通过Blast分析发现，验证出的50个sRNA在牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌中高度保守。对于经过验证的50个sRNA采用的 CopraRNA 软件进行了靶点预测。除此之外，还使用RNA-seq二代测序技术对牛种布鲁氏菌2308中的sRNA进行了测定，共发现了3523条候选sRNA序列。.本研究共构建了50个sRNA的过表达菌株和8个sRNA缺失菌株，并通过巨噬细胞感染实验和小鼠感染实验进行上述菌株毒力的评价。最终成功筛选到BASRⅠ74过表达菌株和BASRⅠ304缺失株在巨噬细胞感染模型中增殖能力显著降低，但是BASRⅠ74过表达菌株在小鼠感染模型中仅表现出脾脏的肿胀程度明显低于亲本菌株，而感染小鼠脾脏的载菌数量与亲本菌株无显著差异。BASRⅠ304缺失株在小鼠感染模型中的毒力测定正在进行中。.在进一步对BASRⅠ74过表达菌株毒力降低相关机制的研究中发现，该sRNA在酸性应激中表达水平显著上调，同时BASRⅠ74的过表达引起了细菌对缺铁环境和营养缺陷环境耐受能力的降低。通过对BASRⅠ74的靶点进行预测和验证发现，BAB1_0847、BAB1_1154、BAB1_1335和BAB1_1361 四个靶基因的表达可能受到BASRⅠ74的直接调控。在这四个靶基因中BAB1_1154 编码一个胞嘧啶-N4特异性DNA甲基转移酶，其他三个靶基因都编码着未知功能蛋白。.本项目的研究结果对探讨布鲁氏菌基因表达的转录后调控和细菌致病机制具有一定的指导意义和学术价值，对于筛选抗布鲁氏菌病药物靶点具有一定的参考价值。