质子泵和柠檬酸利用关键酶在红暗柳甜橙低酸性状形成中的作用研究

'Honganliu' orange is a bud mutant of 'Anliu' orange and its acid content in juice sacs is about one fifth of the wild cultivar. Previous transcriptome, proteome and enzymatic analysis showed that the expression level of a membrane proton pump gene was obviously lower, and enzyme activities or gene transcript levels of two enzymes, belonging to two citrate-utilizing pathways respectively, were significantly higher in 'Honganliu' orange than in 'Anliu' orange, which implied that they likely involved in the formation of low acid-accumulating trait of 'Honganliu' orange. In the present project, we will compare comprehensively the enzyme activities or gene transcript levels of vacuolar proton pump, glutamate decarboxylase and ATP- citrate lyase (two pivotal enzymes in two citrate-utilizing pathways respectively) in juice sacs of two cultivars during fruit development and maturation, investigate the structure difference of putatively important genes, and then identify their function by gene transformation in Hongkong kumquat. On the other hand, we will purify the enzyme protein of proton pump et al. to in vitro compare the responses to their respective enzyme promoters or inhibitors, then use the fruit injection and juice sac in vitro culture technologies by applying their specifically responsive effector to verify their role in the formation of low acid-accumulating trait in 'Honganliu' orange. Through the research, we can clarify the key factor that decide the low-acid character of 'Honganliu' orange and elucidate the possible formation mechanism of the low acid-accumulating trait in 'Honganliu' orange. Results of this research have important significance in the improvement of citrus organic acid regulation theory and settle the theoretical foundation for the subsequent development of fruit acid reduction measures.

红暗柳是暗柳橙的一个芽变品种，汁胞有机酸的含量只有对照的1/5左右。前期转录组、蛋白组和酶学分析发现红暗柳汁胞中膜质子泵基因表达下降、柠檬酸2条利用途径的关键酶活性或基因表达都显著高于对照，暗示与红暗柳的低酸性状形成有关。本项目全面比较两个品种汁胞间质子泵、柠檬酸两条利用途径的关键酶谷氨酸脱羧酶和ATP-柠檬酸裂解酶在果实发育过程中的酶活性和基因表达差异，从基因结构上探讨关键基因差异表达的可能原因；对关键基因进行转基因（转山金柑）功能验证；另一方面，纯化两个品种质子泵等酶蛋白，离体比较它们对各自酶促进剂或抑制剂的反应，确定各酶特异效用物质，然后利用果实注射和汁胞离体培养技术验证质子泵等在红暗柳低酸性状形成的地位。通过研究，鉴定决定红暗柳低酸性状形成的关键因素，阐明红暗柳低酸形成机理。结果对完善柑橘有机酸调控理论具有重要意义，为后续研发果实降酸调控措施奠定理论基础。

红暗柳是暗柳橙的一个芽变品种，主要特点是表现低酸和红肉。本课题按照预定研究计划系统比较了红暗柳和暗柳橙两个品种果实发育过程中柠檬酸积累关键因子质子泵、ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)和谷氨酸脱羧酶(GAD)等酶活性或基因表达变化差异，研究了调控它们的因素以及它们在红暗柳果实低酸等性状中的形成地位；另外以其它柑橘材料为对象，验证了决定红暗柳性状形成的关键因素在柠檬酸积累调控中的地位，取得如下结果。（1）通过挖掘柑橘基因组数据库，获得编码柑橘质子泵、ACL和GAD等基因；（2）系统比较分析发现，质子泵基因在决定果实柠檬酸积累中起到关键调节作用，其中质膜型质子泵基因CsPH8主要位于液泡膜上，其低表达是红暗柳低酸性状的关键原因；ACL和GAD参与了柑橘柠檬酸的降解，但是它们不是决定柠檬酸积累的主要因素；（3）为红暗柳果实性状形成提出了一个合理解释模型。研究发现红暗柳果实的柠檬酸含量虽然极低，但是其柠檬酸合成和降解活力都不低于对照品种，只是其液泡膜上促进柠檬酸积累于液泡内的质子泵活力显著低于对照品种，因此当线粒体内大量合成的柠檬酸进入细胞质后，多数柠檬酸不能进入液泡贮藏，只能在细胞质中迅速降解利用，其中ACL降解柠檬酸形成草酰乙酸和乙酰辅酶A，后者进入次生代谢物质形成的途径，则可能是红暗柳果肉积累番茄红素的重要原因；（4）本研究首次从柑橘果实中克隆到ACL基因，并发现不同品种果实内在品质差异可能与ACL活性密切有关；（5）ABA和干旱胁迫聚能调控柠檬酸积累各关键基因的表达，ACL还受到羟基柠檬酸的调控。.通过本项目的研究，在国际SCI刊源杂志上发表论文5篇，其中反应本课题研究成果的综述文章发表在国际著名的植物科学评论上，2016年IF=6.825；另外，先后有6名硕士或博士研究生的培养受到本课题经费的资助。总之，通过认真执行该项目，圆满完成了预定研究任务、实现了预定研究目标。所获得研究进展丰富了柑橘果实有机酸积累调控理论，为有机酸积累调控奠定了坚实基础。