虫草素激活细胞能量感受器(AMPK)分子机制研究

申请人以人工蛹虫草主要有效成分- - 虫草素的降血脂机理为核心进行研究。.前期工作发现虫草素可显著调节高血脂模型动物的血脂水平；分子对接方法表明，虫草素与细胞能量感受器-AMP激活的蛋白激酶(AMPK)存在相互作用；药理学体内外实验也证实虫草素可激活AMPK，提高磷酸化AMPK的表达并降低细胞内脂质的合成。近期通过冷喷雾质谱技术发现，虫草素仅与AMPK-γ1亚基相互结合。.我们根据前期研究结果推测，虫草素的降血脂作用可能是通过与AMPK-γ1结合，激活AMPK，进而导致下游分子的活化。因此，本申请课题将采用构建AMPK超表达载体﹑RNA干扰及回复实验﹑同位素示踪以及高效液相色谱法等技术手段，在细胞模型上系统探讨虫草素激活AMPK的分子机制，进而为阐明虫草素体内激活AMPK发挥降血脂作用提供前期实验依据。

本课题围绕虫草素降血脂的作用机制开展深入研究，采用了质粒构建﹑RNA干扰﹑同位素示踪及HPLC等技术手段，在细胞模型上系统探讨了虫草素激活AMPK发挥降血脂作用的分子机制。.研究结果证明，虫草素剂量依赖地抑制了肝细胞内的脂质堆积；降低了细胞内甘油三酯、胆固醇和总脂含量显著降低；提高了肝细胞内的脂肪酸氧化并抑制脂肪酸合成。进一步研究表明，虫草素的降脂活性与其激活AMPK的活性密切相关，AMPK特异抑制剂Compound C处理可基本上消除虫草素的降脂作用。分子机制研究表明，虫草素处理并不影响细胞内AMP/ATP的比值，其激动AMPK的作用与CaMKK无关，但通过siRNA下调AMPK上游激酶LKB1的表达水平可显著抑制虫草素激动AMPK的活性。Western blot分析结果显示，虫草素处理并不会显著增加LKB1的表达和活性，因此推测虫草素可能通过直接作用于AMPK发挥作用。分子对接、荧光扫描分析和圆二色谱分析显示，虫草素可以直接结合AMPK-γ1亚基，通过慢病毒介导的基因沉默技术稳定抑制肝细胞中AMPK-γ1亚基的表达，可以基本上消除虫草素激活AMPK的活性和降脂作用，因此证明虫草素是通过直接与AMPK-γ1亚基相结合，促进AMPK的活化，进而发挥降脂作用。.本次课题揭示了虫草素降血脂的作用机制：虫草素通过与AMPK的γ1亚基相作用使AMPK磷酸化表达升高，进而激活下游作用元件发挥降脂作用。研究结果为以虫草素作为先导化合物开展降血脂药物研究提供了关键的理论基础。