肺炎嗜衣原体HSP10的致病作用及信号通路研究

本研究采用细胞生物学技术研究肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumoniae, Cpn）热休克蛋白10（Hsp10）在慢性感染性疾病中的致病作用。探讨Hsp10诱导宿主细胞分泌炎症因子的功能及其相关Toll样受体（TLR）和信号通路。构建相关受体和信号通路关键分子的细胞转染模型，分析TLR、ERK和NF-κB信号通路在介导Hsp10诱生宿主细胞炎症反应中的作用。并以重组蛋白进行动物毒性试验，检测BALB/c小鼠肺病理性改变、血标本及支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞炎症因子水平和T淋巴细胞亚群。本研究为进一步阐明Cpn的致病机制提供理论和实验依据。

本项目基本按照申请要求完成了各项检测指标。通过对CHSP10在体外诱导宿主细胞分泌前炎症细胞因子IL-6、IL-1β等功能的检测，以及ERK信号通路与NF-κB信号通路在CHSP10诱生炎症因子作用的研究，初步阐明了TLR2、TLR4与CHSPs诱生炎症因子及其炎症信号通路之间的关联，这对进一步明确Cpn的致病机制具有重要意义。通过成熟的分子克隆技术及蛋白纯化技术，获得了高纯度并无内毒素活性的CHSP10蛋白样品；发现CHSP10能在体外诱生宿主细胞分泌IL-6、IL-1β等前炎症细胞因子，并且CHSP10诱生前炎症因子的作用根据不同的蛋白剂量及不同刺激时间有所不同，说明CHSP10可能参与Cpn诱导的炎症反应。CHSP10在刺激宿主细胞后，能明显活化细胞的ERK通路，经分析显示在作用30min时活化通路的效果最强，这一点与病原体Cpn相似，而与LPS不同，且经通路抑制剂作用后，CHSP10不仅活化通路的作用大大减弱，其诱生炎症因子的水平也明显减少；CHSP10在作用60min后也能明显活化宿主细胞的NF-κB通路，经通路抑制剂作用后，其活化程度及诱生炎症因子的水平也明显降低，说明CHSP10能通过活化HUVEC的ERK和NF-κB信号通路诱生炎症因子。经质粒、报告基因共转染后，发现转染TLR2和/或TLR4后的实验组细胞经CHSP10刺激后均可显著上调磷酸化ERK的表达；而转染了TLR的实验组，经CHSP10刺激后可显著激活NF-κB信号通路，其中，共转染2种受体的实验组通路活化的程度要高于单项转染组，在单项转染组中，以TLR4介导激活NF-κB活化的作用强于TLR2，说明TLR2与TLR4不同程度地参与介导CHSP10激活ERK和NF-κB信号通路，释放炎症因子的过程。