鼠衣原体TC0668蛋白毒力功能的鉴定及其致病机制研究

At the first time the applicant found that Chlamydia muridarum TC0668 gene is a potential virulence gene. The chlamydia isogenic clone which carry the TC0668 mutation or not will result in statistically different pathogenicity in mouse genital tract, for the mouse genital tract with different activation of tubal inflammation. What’smore, bioinformatics analysis showed TC0668 may have phosphatase activity. In our project, Chlamydia plaque assay and whole genome sequencing are going to be used for screening isogenic clones with different TC0668 genotype. The virulence effect of TC0668 with mouse genital tract pathology were evaluated and its phosphatase activity were detected in vitro. Further more, after TC0668 isogenic clones infecting host cells, variation of Chlamydial and host proteins in its classification, expression and modification were analyzed, and different protein database were established. Analyze the corresponding signal pathway by screening the regulatory moleculars related to inflammatory signal pathway. At last making a comprehensive evaluation on the function of TC0668 protein and its correlation with protein in host cell, and revealing the molecular mechanisms of TC0668 inducing genital pathogenicity by activating inflammation. It may provide some theoretical and experimental reference for prevention and treatment of chlamydial disease.

TC0668基因是申请者首次发现的一种潜在Cm毒力基因。前期研究发现含野生型和突变型TC0668基因的菌株在小鼠生殖道会造成差异明显的病变，且病变的根源在于病变组织炎症反应的不同，同时，生物信息学分析显示TC0668蛋白可能具有磷酸酶活性。因此，本课题拟采用衣原体噬斑筛选技术结合全基因组测序，筛选TC0668单基因差异型菌株，在动物模型内验证其致病作用，并通过体外实验鉴定其磷酸酶活性。进一步以TC0668单基因差异型菌株感染宿主细胞，分析菌株感染后引起衣原体及宿主蛋白在表达种类、水平及修饰状态的差异，建立差异蛋白质数据库。通过筛选炎症信号通路调控分子进行相关信号通路的验证。综合评价TC0668蛋白功能及其与宿主细胞蛋白的相互关系，揭示TC0668蛋白调控炎症反应，影响生殖道病变产生的可能分子机制。为衣原体疾病的预防、治疗提供重要的理论和实验依据。

明确衣原体感染如何引起上生殖道病变是解决衣原体性不孕不育的重要前提。TC0668是项目主持人首次发现的一种潜在的衣原体毒力因子。前期研究发现tc0668基因突变的衣原体菌株在小鼠生殖道的致病性会显著下降，但TC0668在衣原体致病中如何发挥作用尚未可知。本项目通过衣原体噬斑实验筛选特定基因型别的衣原体单克隆菌株，建立了多组仅在tc0668基因上存在差异的tc0668单基因差异型衣原体菌株库；通过多组匹配的tc0668单基因差异型衣原体菌株构建小鼠生殖道感染模型，证实 tc0668单基因突变可使衣原体菌株致小鼠输卵管水肿率明显下降（20%），而tc0668基因联合tc0237基因的双突变则可使衣原体菌株的致病性进一步下降（0~20%），明确了TC0668在衣原体中的毒力功能[Pathogens and Disease, 2019, 77(3), ftz017]；通过制备TC0668的纯化蛋白和多克隆抗体，对TC0668在衣原体中生物学特性进行分析，证实TC0668是一种定位于衣原体EB/RB膜上的结构蛋白，少量可分泌到衣原体包涵体的囊腔中，可能也是一种非常规性的衣原体分泌蛋白；TC0668在衣原体发育周期的中后期大量表达，可能与RB向EB转化以及EB的成熟有关；同时，该蛋白通过调控宿主细胞多种细胞因子的分泌，引起输卵管局部组织慢性炎症反应导致不可逆性输卵管水肿[正在投稿中]；以tc0668单基因差异型菌株平行感染宿主细胞，基于iTRAQ定量的蛋白质组学分析显示TC0668通过活化NF-κB、PI3K-Akt、氧化磷酸化相关的多条信号通路，调控白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死相关因子等多种分子表达，参与细胞代谢、免疫应答和生物调控等生物学过程来发挥致病作用[Frontiers in Microbiology, fmicb. 2019.02553]。本研究项目对衣原体新型毒力因子TC0668的致病作用尤其是致病机制进行了阐明，综合评价了TC0668蛋白功能及其与宿主细胞蛋白的相互关系，揭示TC0668蛋白调控炎症反应，影响生殖道病变产生的可能分子机制。为衣原体性不孕的预防、治疗提供重要的理论和实验依据。