蜡梅花香成分的生物合成及其调控机制研究

蜡梅为我国特有的香花植物，资源丰富，在切花、盆景及香精开发均具很大潜力。前期项目组克隆了控制水杨酸甲酯合成的水杨酸羧基位甲基转移酶(SAMT)基因、控制法呢基焦磷酸合成的法呢基焦磷酸合成酶（FPPS）基因，并对其进行了表达与功能分析，本项目以此为基础，构建蜡梅花cDNA文库，分离纯化相应的酶蛋白，进行蛋白测序；利用所得序列来筛选文库，这样可以获得包括蜡梅主要成分的LIS基因、β-罗勒烯合成酶基因和BEAT基因。另外，大量进行表达序列标签（EST）的测定以及对这些EST序列的分析，也有望获得更多新的花香相关基因。对克隆的这些基因在开花的不同时期和不同花器官的表达、花香产物的含量及花香相关酶的活性变化的分析，结合相关酶亚细胞定位，从而地将基因表达、酶活性和产物释放联系起来，了解花香产物生物合成及调控的机制。为最终阐释花香成分合成及散发的机理、香味基因工程及蜡梅花香精的开发利用奠定基础。

为了探明蜡梅花香成分生物合成及其调控机理，项目以蜡梅株系H29和H64为研究材料，完成了转录组的测序和不同时空的表达谱分析，其中红心品种H29的转录组共得到3.8Gb的测序碱基数， 素心品种H64的转录组共得到测序碱基数4.8Gb，两库整合后所得 Unigene 8.3万多条，具有功能注释的Unigene 5万多条。找到花香相关Unigene 258条，包括萜烯类挥发物合成相关Unigene101条， 苯丙氨酸衍生物／苯丙素类挥发物相关Unigene157条。两个株系间差异表达Unigene89条；H29花芽与盛花期差异表达Unigene 共34条，中、内被片差异表达Unigene共26条。采用RACE技术对筛选出的候选Unigene 进行全长克隆，获得花香相关候选基因12个（包括前期通过同源克隆法得到的法呢基焦磷酸合成酶CpFPPS和水杨酸羧基位甲基转移酶CpSAMT 2个基因），重点对芳樟醇合成酶CpLINS、罗勒烯合成酶CpZbetaOS、花香转录因子CpODORANT1-41978等7个基因进行了序列分析、蛋白质基本性质分析，二级结构、三级结构预测以及系统进化分析。对CpFPPS和CpSAMT 基因进行了实时定量表达分析以及原核表达分析，明确了其时空表达规律，验证了这2个基因的功能。对CpSAMT基因以及2个ODORANT1转录因子进行了转基因研究，CpSAMT已转入烟草和矮牵牛两种模式植物中，大部分转基因植株出现表型，转基因矮牵花香成分发生一定的变化，2个ODORANT1转录因子已分别成功转入烟草和拟南芥，转基因植株的表型特征还尚在观测中。此外对包含H29和H64在内的共9个蜡梅株系进行了花香成分的定量分析，对于花发育不同时期以及不同部位分别测定。共鉴定出相对含量超过1％的挥发物26种，萜烯类挥发物23种，苯丙氨酸衍生物／苯丙素类挥发物3种。其中，初开期、盛花期和末花期花香成分相对含量较多，花香挥发物主要来自花瓣。不同品种挥发物的成分以及相对含量差异较大，H64和H29花瓣挥发物的主成分，乙酸苄酯、芳樟醇、水杨酸甲酯含量都较高，H64还含有较多的δ-香杜松萜烯，而H29则含有较多的苯甲醇。课题组通过对H29和H64进行杂交，构建了拟侧交F1代群体，将用于构建蜡梅遗传图谱以及花香相关基因的定位研究。这些研究为最终揭示花香生物合成及其调控机理奠定了基础。