荷叶铁线蕨无配子生殖形成多孢子体行为的相关基因挖掘与功能分析

荷叶铁线蕨(Adiantum reniforme L. var. sinense Y. X. Lin)为国家二级重点保护的濒危植物，仅分布于我国四川重庆三峡地区的狭窄区域。是室内观叶植物的好材料，又具有很大的药用价值。荷叶铁线蕨通过无配子生殖形成多孢子体现象为本课题组发现的一种独特的生殖方式，项目利用转录组学的RNA 测序技术，获得无配子生殖发生多孢子体在转录水平上的差异，利用高通量测序仪测序获得足够的序列，克隆相关基因。研究相关基因的功能，并利用RT-PCR、原位杂交等技术，分析其表达。同时通过外源激素、无机营养物质调控优化稳定的培养体系，研究其细胞结构与微观形态。最后综合上述结果，试图解析这一独特生殖方式的调控机理。项目研究成果对于揭示蕨类植物无配子生殖以及被子植物的无融合生殖的机理具借鉴意义。通过无配子生殖形成多孢子体的方式对于蕨类植物产业化也具有重要指导意义。

荷叶铁线蕨通过无配子生殖形成多孢子体现象为本课题组发现的一种独特的生殖方式，本项目获得了稳定的配子体无性生殖及其有性生殖方式形成多孢子体的培养体系，经鉴定得知：无性孢子体仍然保持了和配子体一样的“单倍体”状态。对无配子生殖方式的配子体进行转录组测序与表达谱分析，获得了长度大于 100bp 的unigene 62198条。COG功能注释，有24319个Unigene 分布于25个COG分类中，其中聚类到一般功能预测的Unigene 最多，其次与转录、翻译、复制，代谢运输，染色体结构与修饰等方面有关。对转录组库中的unigene进行分析比对，筛选出了与性器官分化及胚胎发生有关的同源基因498条，涵盖对细胞周期和细胞壁的应答、激素应答、体细胞胚胎发育过程中信号转导途径相关的基因、转录因子四个方面，包括MADS-box，wox，Knox，PIN等与被子植物花器官发生有关的转录因子家族。筛选到两条重要pathway，分别是SERK和Ca2+转导途径。这两条途径在被子植物中是与体细胞胚胎发生以及性器官分化有直接关系的代谢途径。进一步分析无配子生殖各时期表达谱，寻找到可能与无配子生殖相关的基因其中糖代谢中的关键基因8条，激素信号转导途径中关键基因6条，其中与生长素有关的基因1条，为AUX转运蛋白基因，与细胞分裂素相关的节点基因2条，为水解糖基化基因和吲哚-1，3-β-葡萄糖苷酶基因与油菜素内固醇相关的基因3条，包括1条类PTI1酪氨酸蛋白激酶基因和2条丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因。对筛选出的候选 Unigene 进行全长克隆，共获得与无配子生殖相关的转录因子及功能基因6个。包括两个KNOX类基因，一个WRKY类转录因子，一个NAC类转录因子，一个与叶绿体发育有关的基因RBC，一个与花器官分化有关的转录因子WOX8。采取了荧光实时定量技术对上述基因进行分析表明，NAC和WRKY基因在无性胚细胞分化时期呈现出较高的表达量。RBC基因在性器官分化时期呈现明显的下调表达，而在无配子生殖时期呈现逐渐递增的趋势。进一步对进行遗传转化，目前已将KNOX2、WRKY、NAC、RBC基因转入烟草和拟南芥两种植物中，经PCR检测目前已经获得阳性苗，初步观察表明：KNOX2基因在拟南芥中有明显推迟花期的作用。上述研究结果对于揭示无配子生殖的分子调控机理奠定了基础。