铅/锌超富集植物小花南芥内生菌群落结构及其强化宿主富集铅锌的机制研究

It was found that endophytes are ubiquitous in plants growing in heavy-metal (HM) polluted areas, and they have an important effect on host plants' environmental adaptation and HM accumulation. However, little is known about the community structure, the active components and the mechanism of improving hostplant's Pb/Zn accumulation by endophytes and ecological function in situ of endophytes of plants in HM-contaminated areas. In order to understand the response and characteristics of the community structure of endophytes at HM stress, Arabis alpine, a Pb/Zn hyperaccumulator plant in Huize Lead-zinc mine, Yunnan province, China, will be collected and the 16S and 18S rDNA of endophytes associated with the plant will be amplified and then pyrosequenced. Then, to understand the ecological function of endophytes, the endophytes from Arabis alpine will be inoculated back to the sterile seedlings and pot experiments will be conducted at the greenhouse. Finally, the metatranscriptoms of Arabis alpine from HM-contaminated site and uncontaminated site will be extracted, pyrosequenced and analysed. Based on the data from our research and the database, the mechanism of improving hostplant's Pb/Zn accumulation by endophytes the endophytes ecological function in situ should be discovered. The results of this research will supply some important information for the exploration of endophytes in the bioremediation of HM-polluted areas.

内生菌（Endophyte）广泛定殖于重金属矿区植物各组织器官内，对矿区植物的生态适应性和重金属富集能力等有重要影响，在微生物-植物联合修复重金属污染土壤方面显示了巨大的应用潜力。但有关矿区植物内生菌的群落结构、增强宿主重金属富集能力的关键功能群及其功能机制却不清楚。本项目拟在前期研究基础上，利用16S和18S rRNA基因扩增、高通量测序的方法，对Pb/Zn超富集植物小花南芥（Arabis alpina）的内生菌进行研究，探明铅锌镉污染环境中内生菌群落结构特点；温室控制条件下，探明内生菌群落在小花南芥Pb/Zn超富集中的生物学功能；在此基础上，通过对污染区和非污染区小花南芥内生菌元转录组文库的构建、测序及生物信息学分析，获得和重金属富集相关的功能基因，揭示内生菌在重金属富集过程中可能的作用机制和分子机理，为内生菌-植物联合修复重金属污染区的研发奠定理论基础。

本项目利用高通量测序的方法，系统研究了重金属超富集植物小花南芥（Arabis alpina）内生菌（内生真菌和内生细菌）群落结构特征，发现了矿区小花南芥地上部分及地下部分内生菌群落组成的差异。在门、纲分类水平上，其地上和地下内生真菌最优类群相同，均为子囊菌门（Ascomycota，95.08%）、粪壳菌纲（Sordariomycetes，72.16%）。然而在目、科、属、种水平上，优势类群各异。其中属水平上，地上部分丰度较高的是四枝孢属（Tetracladium）和枝孢属（Cladosporium），而地下部分则是四枝孢属和裂壳菌属（Schizothecium）。其地上及地下部分内生细菌的OTU数分别为2439和1856，其中Pseudomonas是地上和地下部分最优势的内生细菌，分别有81.56%和41.60%的序列被注释为该属。无论是OTU数还是多样性，小花南芥都明显低于生长于同一环境的中甸长果婆婆纳（非重金属超富集植物、其生长环境土壤重金属含量显著低于小花南芥生长环境土壤）。此外，我们采用传统内生菌分离培养方法，对小花南芥可培养内生真菌群落结构进行了研究，并对部分菌株的重金属抗性及其增强宿主植物重金属抗性进行了研究。筛选获得一批重金属抗性较好的菌株，其中的镉毒理兴奋型菌株FXZ2（Epicoccum nigrum）表现较为突出，可耐受220 mM/L的 Cd（Ⅱ）。在复合重金属胁迫下，能显著促进小花南芥的生长（P < 0.05，T检验），降低其地上部分的Pb含量（P < 0.05），增加Cd（P < 0.05）和Zn（P > 0.05）含量。内生菌群落接种研究也表明，内生菌群落能够显著促进小花南芥在复合重金属胁迫条件下的生长（P < 0.05）、降低其地上部分的Pb（P < 0.05）和Cd（P > 0.05）含量，增加Zn含量（P < 0.05）。为揭示内生菌增强宿主植物在重金属胁迫条件下的生长、影响其重金属累积的分子机制，我们对内生菌群落及菌株FXZ2接种小花南芥6、12、24、36h后的转录组进行测定。总之，我们的结果初步阐明了矿区超富集植物小花南芥内生菌群落结构特点，筛选获得了具有较强重金属抗性的菌株、揭示了内生菌及其群落对宿主重金属耐受性的影响及其机制、为重金属污染土壤的植物-微生物联合修复提供了理论依据和菌种资源。