基于小分子单抗特异性敲除技术的葛根素与葛根功效相关性的研究

The correlation between indicators and its efficacy in the Chinese medicine herbs is the key scientific issues of basic and applied research of Chinese medicine. In this study, we choose Radix Puerariae which has exact efficacy and basic research results as a template, Puerarin monoclonal antibody as a tool to establish the "specific knock out the Puerarin" technology, and then get the Pueraria water extracts which has specific knock out Puerarin, as well as the Pueraria water extracts artificially adding in different content of Puerarin, In order to clarify the correlation between Puerarin and Radix Puerariae in drug efficacy and contribution, we take difference compared method as research methods, use animal and cell models corresponding to the traditional attending effect and the pharmacological effects of the herb, take a combination of in vivo and in vitro, static and dynamic, efficacy and biological indicators as evaluations criteria, and then analyze the relationship in efficiency - the amount - diameter - the mutual between them through the establishment of the immunoassay method of high sensitivity, specificity, suitable for micro-biological samples. After complete the above-mentioned study and achieve the desired objectives, we can not only clarify the material basis of Radix Puerariae and Puerarine in pharmacodynamics, but also provide the exact basis for index components in the quality control of Pueraria herbs compatibility mechanism, metabolic studies, preparation process and other aspects. We can lay a solid foundation for the relevance of the research methods in Chinese herbal medicines and their efficacy using specific knock out index components method, so that this new technical means can be more widely available.

代表性成分与药物功效之间的关联度，是中药研究的基本科学问题。本研究选择功效和基础研究结果确切的葛根药材为模板，利用葛根素单抗为工具，建立特异性敲除葛根素的技术方法，获得特异性敲除葛根素后的葛根水提物，并在此基础上人为添加不同含量葛根素的葛根水提物，通过差异性比较的方法，借助与葛根传统主治功效与现代药理作用相对应的动物和细胞模型，以体内与体外、静态与动态、药效与生物学指标相结合的评价标准，阐明葛根素与葛根功效之间的关联性与贡献度，进而通过建立灵敏度高、特异性强、适宜微量生物样品的免疫分析方法，解析它们之间在效-量-径-位方面的相互关系。上述研究目标的实现不仅可为葛根素作为葛根药材的质量控制、配伍机理、代谢研究、制备工艺等方面的研究指标成分提供确切依据，而且能够奠定利用特异性敲除法研究中药材指标成分与其功效的相关性研究方法的坚实基础，从而使这一新的技术手段得以更广泛的利用。

目前普遍采用的从全成分角度阐释中药复杂体系的药理作用并不是解析中药物质基础和药理作用的最佳途径，本研究采用特异性敲除法研究化学成分与中药功效关联度的思路是最符合中药整体观的新思路。.利用葛根素单抗制备了免疫分析试剂盒，建立的ELISA法与HPLC法具有良好的相关性（R>0.999），该方法灵敏度高、特异性强、方便快捷，是葛根药材及其复方含量测定的新方法。特别适用于基质复杂的生物样品的测定，通过尾尖取血完成了在单只清醒小鼠体内整条药代曲线的描绘；通过检测MCAO和正常大鼠脏器及海马中葛根素的含量，为葛根素治疗脑中风的作用机理提供了重要依据；通过检测唾液中的微量葛根素，完成了无创人体药代动力学研究，为中药药代动力学的研究开创了新的纪元。.单抗与荧光素FITC结合，探讨了葛根素在HUVEC细胞上的作用靶点，为中药靶点研究探索了一条全新的方法。结合胶体金技术和量子点技术分别制备了葛根素胶体金试纸和量子点试纸，实现了几分钟内微量样品的定性或定量，为中药快检系统的建立奠定了基础。.利用纯化的葛根素单抗，制备免疫亲和色谱柱，实现了从葛根提取液中特异性敲除葛根素，再通过定量加入的方法制备葛根素含量不同的样品，经药效学对比研究葛根素对葛根功效的贡献度，开创了整体观在中药物质基础研究上的新局面。小鼠解热实验表明，随着葛根素增加解热作用增强；高糖模型HUVECs细胞实验显示葛根素与降糖作用相关；糖氧剥夺损伤SH-SY5Y细胞模型，显示葛根素主要通过下调NF-κB、TNF-α水平，改善SOD含量、减少MDA、NO来抑制炎症；利用人乳腺癌T47D细胞实验，发现葛根素通过ERβ途径发挥雌激素作用；利用平滑肌舒张实验，揭示葛根素从eNOS途径和雌激素受体途径发挥舒血管效应；利用LPS诱导巨噬细胞炎症模型，揭示葛根素抑制IL-1β的分泌。.另外，建立了交叉反应化合物库和阳性克隆细胞库，为开展深入研究奠定了基础；形成了中药小分子化合物单克隆抗体制备、纯化、免疫分析试剂盒、色谱柱、胶体金和荧光试纸条的SOP，为同类研究提供了模板。