基于铝抗性及敏感大豆种质进行铝抗性相关ABC转运蛋白基因的筛选、鉴定及其分子机制研究

Aluminum (Al) is one of the major limiting factors for crop production in acid soil which accounts for 30%-40% of the global arable land. Previous studies suggested that some ATP-Binding Cassette (ABC) transporters play key roles in the process of plant Al-resistance, but their molecular mechanism remains not well understood, Our previous proteomics study revealed that ABC transporter of soybean is involved in response to Al stress, however, there are more than 200 putative ABC transporter genes in soybean genome, but the detailed number and molecular mechanism of Al-resistance related ABC genes among them remain unclear till now. In this project we will apply two different soybean genotypes, Al-resistant and Al-sensitive soybeans, to screen the key ABC transporter genes by using PCR methods with the gene-specific primers of the ABC family genes in the GenBank database of soybean, and clarify the molecular mechanism and function of these genes involved in the soybean Al-resistance by the transgenic method (introducing them into the Al-sensitive soybean genotype for function analysis), qPCR, confocal laser scanning microscopy(CLSM), secondary ion mass spectrometry (SIMS) and inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES) methods. The implementation and completion of this project could excavate key target genes for breeding new Al-tolerant soybean variety and provide experimental and theoretical basis for deeply understanding the Al-tolerant mechanism of plants.

酸性土壤占全球可耕地面积的30%～40%，铝毒是酸性土壤中限制作物产量的关键因子之一。已有研究表明，一些ABC转运蛋白在植物抗铝胁迫过程中起着关键作用,但其分子机制还不很清楚。我们前期的蛋白质组学研究发现ABC转运蛋白可能参与了大豆的抗铝胁迫；然而大豆中含有超过200个预测的ABC转运蛋白基因，其中参与铝抗性的成员具体数量及其分子机制，至今尚不清楚。本项目拟以铝抗性（BX10）和敏感大豆(BD2)种质为材料，根据大豆数据库中ABC转运蛋白家族基因序列，设计特异性引物进行PCR筛选出可能在大豆抗铝胁迫中起关键作用的ABC基因，并采用转基因（导入铝敏感大豆种质中）、qPCR、CLSM、SIMS、ICP-AES等技术手段，鉴定其在大豆抗铝胁迫中的功能并研究其分子机制。本项目的实施和完成，将为抗铝大豆新种质的培育提供潜在的关键靶标，并为深入理解酸铝土壤中植物的抗铝毒机制提供实验与理论依据。

酸性土壤占全球可耕地面积的30%～40%，铝毒是酸性土壤中限制作物产量的关键因子之一。已有研究表明，一些ABC 转运蛋白在植物抗铝胁迫过程中起着关键作用,但其分子机制还不很清楚；也有研究提示，微小RNAs (miRNAs) 不仅参与植物生长发育的调控，也参与植物响应外界胁迫的反应包括铝胁迫。.本项目以铝抗性大豆（BX10）和铝敏感大豆(BD2)种质为材料，通过高通量测序技术及生物信息学分析，筛选了响应铝胁迫的一些关键基因及关键miRNA等，主要研究成果包括：（1）成功构建了铝胁迫与对照处理下两种基因型大豆幼苗根尖组织的4个转录组文库，并通过高通量测序及分析，共获得469个差异表达的基因，从中筛选出242个与铝胁迫相关的差异表达基因，包括11个ABC转运蛋白基因；(2)BX10大豆中编码丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达上升，而编码ATP-柠檬酸裂解酶的基因表达下调，又，柠檬酸转运相关的通道蛋白基因表达显著上升，提示BX10比BD2具有更高的柠檬酸代谢和分泌能力；（3）铝胁迫下，BX10大豆中促进细胞壁加厚的富含羟脯氨酸的糖蛋白基因和促进细胞壁延伸的细胞膨胀素基因的表达显著高于铝敏感大豆BD2；（4）NADH脱氢酶基因在BX10大豆中上调而在BD2中下调，暗示BD2中的活性氧含量高于BX10；（5）用根癌农杆菌介导的Jack大豆子叶节遗传转化，获得了转GmPDR12 基因植株；（6）用发根农杆菌介导的Jack大豆子叶节遗传转化，获得了转GmPDR12 基因毛状根；（7）成功构建了铝胁迫处理与对照处理下两种基因型大豆幼苗根尖组织的4个小RNA文库，通过高通量测序及分析，共获得453个miRNA，从中筛选出32个铝响应的差异表达miRNA，并利用psRNATarget软件对31个铝响应miRNA的预测而得到237个靶基因；（8）运用RLM-RACE 验证了miR166等关键miRNA的靶基因；（9）铝胁迫显著抑制了BD2中的miR169r的表达，其靶基因(FPS1)表达提高，导致过氧化氢的含量高于BX10；（10）铝胁迫抑制了BX10中的miR166等表达，其靶基因(HD-ZIP)表达提高，与BD2相比，更有利于维持根尖分生区细胞的分裂和分化。.本项目研究结果，为解析不同基因型大豆耐铝性差异的分子机制提供了新视角，也为培育耐铝大豆新种质奠定了一些理论基础。