二化螟多重抗性相关ABC转运蛋白基因的筛选与功能研究

The pest populations in the field produced multiple insecticide resistance due to often being highly selected by a variety of insecticides. However, there have been few studies about the mechanism of multiple insecticide resistance on insect, the current research results can't fully explain the mechanisms for multiple insecticide resistance. The ATP-binding cassette (ABC) transporter are a large group of membrane proteins that couple transport of binded subtrates across the cell membrane by expelling them out of the cells against a chemical gradient and energized directly by the hydrolysis of ATP. It is a major contributor to insecticides resistance by inhibiting the accumulation of intracellular insecticides and their metabolites. In order to demonstrate the molecular mechanism for multiple insecticide resistance of pests, this project use the economically important rice pest insect, Chilo suppressalis as material, the laboratory C. suppressalis strains was selected, showing high resistance to abamectin and chlorantraniliprole. The important ABC transporter genes associated with the multiple insecticide resistance in C. suppressalis will be found by using RNA-seq, whole genome sequencing, RNAi and qRT-PCR techniques. To clarify the role of ABC transporter in the multiple insecticide resistance, the cell lines expressing these ABC genes are constructed, the accumulation and efflux of [3H]-abamectin and [3H]-chlorantraniliprole in these cell lines will be tested by isotope labelling technique. The results of the present project can unravel the molecular mechanism for multiple insecticide resistance of pests and enrich the theory of insecticide resistance, as well as to provide basic information for developing resistance reversers.

田间害虫种群往往遭受多种药剂的选择而产生多重抗性，但有关害虫多重抗药性分子机理的研究鲜有报道，目前的研究结果无法完全解释害虫多重抗性形成的原因。ABC 转运蛋白是一类利用 ATP 水解产生的能量将与其结合的药物逆浓度梯度泵出细胞的跨膜运输蛋白，其通过抑制细胞内药物及其代谢产物的积累对抗性起作用。本项目拟以重要水稻害虫二化螟为对象，在目前获得了二化螟阿维菌素抗性品系、氯虫苯甲酰胺抗性品系以及阿维菌素﹒氯虫苯甲酰胺多重抗性品系基础上，采用转录组测序、全基因组重测序、qRT-PCR和RNAi技术，筛选出与多重抗性相关的ABC基因；构建表达目标ABC基因的细胞系，采用同位素标记技术检测阿维菌素和氯虫苯甲酰胺在细胞内的累积水平和被细胞外排的水平，明确ABC转运蛋白在害虫多重抗性中的作用。研究成果有助于阐明害虫多重抗性分子机理，丰富害虫抗药性理论，同时为以ABC转运蛋白为靶标设计的抗性逆转剂提供依据。

田间害虫种群往往遭受多种药剂的选择而产生多重抗性，但有关害虫多重抗药性分子机理的研究鲜有报道，目前的研究结果无法完全解释害虫多重抗性形成的原因。ABC转运蛋白是一类利用ATP水解产生的能量将与其结合的药物逆浓度梯度泵出细胞的跨膜运输蛋白，其通过抑制细胞内药物及其代谢产物的积累对抗性起作用。本项目以重要水稻害虫二化螟为对象，首先综合公共数据库、二化螟转录组和基因组数据，鉴定到47个二化螟ABC转运蛋白基因。这些基因包括8个亚家族：5个CsABCA、7个CsABCB、10个CsABCC、2个CsABCD、1个CsABCE、3个CsABCF、15个CsABCG和4个ABCH基因。接着，在二化螟对氯虫苯甲酰胺（中等水平、高水平、极高水平）抗性品系、阿维菌素（高水平）抗性和阿维•氯虫双抗品系中检测47个ABC基因的表达量，筛选出了与阿维•氯虫多重抗性相关基因（C5、G2、G13、G12、、G5、A5、G11、G4、F1、H2等）。进一步，分别对阿维菌素、氯虫苯甲酰胺、阿维•氯虫多抗品系与敏感品系进行全基因组重测序和转录组测序，结合SNP/InDel 与差异表达分析，鉴定出与氯虫苯甲酰胺抗性或阿维•氯虫多重抗性相关的基因，如ABCG1、转录因子kayak、幼虫/蛹硬角质层蛋白66、表皮蛋白1、转化生长因子β-1诱导的转录物1蛋白和谷胱甘肽S-转移酶2等。然后，对筛选出的基因通过“RNAi +氯虫苯甲酰胺 / 阿维•氯虫”进行功能验证。研究发现，干扰ABCH2后，二化螟4龄幼虫对氯虫苯甲酰胺的敏感性显著提高，但将H2导入细胞后，使用效率更高的CCK-8法检测细胞活性，尚未发现过量表达的H2有对细胞免受杀虫剂毒害的保护能力。此外，分别将A1、D2基因干扰后，4龄幼虫对杀虫剂的敏感性与对照组无差异。本研究结果为阐释ABC基因在二化螟对杀虫剂多重抗性中的作用奠定了理论基础。