ABC转运蛋白在昆虫穿透抗性中的作用机理研究

The decrease of cuticle permeability in insects plays important roles in the resistance to the insecticides. However, the molecular mechanism underlying the resistance is not clear. This proposal aims to study the role of ABC (ATP-binding cassette) family proteins in the resistance to avermectin (AVM) in Drosophila by using RNA sequencing based transcriptomics in combination with molecular and cell biology approaches. To investigate the ABC family proteins that are important for the AVM-resistance, we will compare transcriptome profiles in the barrier tissues such as epidermis, blood-brain barrier, and intestinal epithelium between the sensitive and resistant strains. Furthermore, we will generate insect cell models in which the key ABC genes are knocked-down or overexpressed, and then compare their transcriptomes in order to determine the upstream or downstream key regulatory molecules of ABC proteins and to construct the regulatory networks for ABC proteins. Altogether, we will reveal the role of ABC family proteins and related regulatory networks in the insecticide resistance. The project will facilitate our understanding of the molecular mechanisms of insect resistance, and help resolve the problem of insecticide resistance.

穿透抗性是昆虫三种主要抗药性机制中的一种，但其详细的分子机理并不清楚。本申请项目以广泛使用的阿维菌素（AVM）作为测试农药，以实验室筛选获得的抗AVM果蝇为研究对象，利用全转录组测序技术及分子和细胞生物学技术平台，深入研究ABC转运蛋白（ATP结合盒）家族在昆虫穿透抗性中的作用及其调控机理。主要目标为通过建立AVM抗性果蝇及AVM敏感果蝇的转录组表达谱，筛选与AVM抗性相关的关键ABC基因；构建此ABC基因不同表达水平（敲减和过表达）的昆虫细胞模型，利用组学技术、生物信息学技术及相关数据库，发现影响及调节这些ABC基因的上下游信号分子并对其进行验证。综合以上信息，解析AVM抗性昆虫的ABC相关基因的表达调控网络并分析抗性机制。预期此项研究不仅揭示ABC转运蛋白家族在穿透抗性中的作用及其相关调控机理，而且将为理解昆虫非特异性抗性的分子机理提供新的视角，并为害虫抗性治理研究提供重要的科学依据。

阿维菌素（avermectins）是一类应用广泛的农药，由于大范围长时间的使用，已在多种害虫上发现了阿维菌素抗药性，而关于抗药性机制研究主要在代谢抗性和靶标抗性两方面，对穿透抗性的研究较少且主要集中于表皮厚度的增加和表皮重塑方面，近年来对于抗性机制的研究也逐渐关注到ABC（ATP-binding cassette）家族转运蛋白，但除了对P-gp的研究外，对于ABC家族其他成员的功能研究鲜有报道，尤其是缺乏在昆虫杀虫剂抗性方面的研究。..本项研究以阿维菌素敏感品系（以下简称敏感品系）和对阿维菌素抗性品系（以下简称抗性品系）的果蝇及S2细胞分别为体内和体外模型，研究ABC转运蛋白在果蝇阿维菌素穿透抗性中的作用。通过转录组学测序，分别比较敏感品系和抗性品系果蝇的转录组数据，共有1355个差异基因，结合本实验室在此之前发现的P-gp可能在阿维菌素抗性中的作用，单独分析ABC家族中的成员在敏感品系和抗性品系中的区别，筛选并确定了属于ABC转运蛋白家族成员的5个差异表达基因，后经Q-PCR验证确定在体内外模型中真实存在差异表达的ABC家族基因共4个：CG5789、CG31731、E23和Atet。分别在果蝇和S2细胞上对这些基因进行敲减表达，发现E23基因敲减后的果蝇在点滴阿维菌素后存活率显著降低，而在S2细胞上的敲减也发现染毒阿维菌素后细胞活性显著下降，推测E23可能参与阿维菌素的外排过程，继而进一步对E23基因的生理功能开展深入研究，发现在E23基因敲减后，其细胞内蜕皮激素含量增多，几丁质层变薄，对阿维菌素毒性的敏感性增加；当E23的表达增强后，细胞内蜕皮激素含量降低，几丁质层变厚，对阿维菌素的耐受性增加。这些结果表明E23可能参与调节包括蜕皮激素和几丁质层结构的过程，后者则是形成昆虫穿透抗性的重要因素。..上述研究明确揭示了E23基因和AVM抗药性之间的关系及其调节机制，这一研究结果不仅为昆虫的穿透抗性机制产生的过程提供重要参考，也为ABCG家族蛋白的其他成员在药物抗性问题的研究上提供科学依据。