蛹虫草发育过程中蓝光诱导的初步研究

蓝光可以调控蛹虫草某些药用有效成分的含量和分生孢子的数量，表明蛹虫草中存在一个蓝光调控系统。本研究通过对蛹虫草基因文库的构建，根据已报道的其他真菌的蓝光受体蛋白基因和蓝光诱导蛋白基因序列，制备探针，从文库中进行蓝光受体蛋白基因和蓝光诱导蛋白基因的克隆和测序；或者根据其他生物蓝光受体蛋白基因序列设计引物，采用RACE方法，进行该蛋白质基因的PCR扩增，获得蓝光诱导蛋白质的基因序列。可将上述方法获得的蓝光受体蛋白基因构建表达载体，在原核中进行表达，制备抗血清，用以检测蓝光诱导下蓝光受体蛋白和蓝光诱导蛋白基因的表达水平，同时采用荧光免疫技术进行细胞内定位。通过上述研究，初步弄清蓝光调控系统对蛹虫草发育过程中某些药用成分代谢和无性繁殖方面的影响。

蓝光是很重要的环境因素，可以引起生物体的生理和生化的变化。(1) 采用黑暗摇瓶发酵和蓝光照射静置培养的两步培养法，进行蛹虫草（Cordyceps militaris L.）液体发酵产类胡萝卜素的蓝光诱导。结果表明蛹虫草在2d的黑暗培养和5d的蓝光照射静置培养后，其类胡萝卜素的含量可达到最高值的558.4μg/gFW。而以黑暗摇瓶培养2d后，进行不同时间的蓝光照射静置培养。结果表明，蓝光照射最初2d，蛹虫草类胡萝卜素含量变化不明显，随后快速增加，并在第5天达到最大值的558.4μg/gFW，随后类胡萝卜素的含量并无明显变化。通过该研究解决了蛹虫草液体发酵产类胡萝卜素的培养过程中蓝光的给光问题。 (2)通过PCR得到CmWC-1、CmWC-2基因开放阅读框(ORF)序列，全长分别为2823 bp和1575 bp。序列分析表明CmWC-1基因ORF翻译后氨基酸序列长度为940 aa，推测此蛋白为GATA型锌指结合蛋白。CmWC-2基因ORF翻译后氨基酸序列长度为525 aa，推测此蛋白为Cutinase palindrome-binding protein (PBP)蛋白。(3) 通过实时荧光定量PCR对蛹虫草蓝光受体基因CmWC-1、CmWC-2基因在蓝光诱导下表达量变化进行研究，结果表明CmWC-1、CmWC-2基因在有无蓝光诱导的条件下均有一定量的表达，其中在黑暗培养条件下，CmWC-1基因相对表达量最高，达到0.44；蓝光诱导条件下，在16 h处出现相对表达量峰值0.37。与CmWC-1基因不同，CmWC-2基因在蓝光诱导16 h时相对表达量达到峰值3.28，黑暗和其他蓝光诱导时间段表达量均比较低。这表明蓝光的直接照射可以导致CmWC-1和CmWC-2基因表达水平的改变。(4)经过PCR后，CmHK和CmKexin基因的ORF分别为2931 bp和2562 bp。CmHK基因可编码976个aa。CmKexin基因可编码853个aa。(5) 运用实时荧光定量PCR方法研究，蓝光诱导CmHK、CmKexin基因表达量的峰值分别在蓝光照射的16 h和50 h。