蛹虫草组氨酸激酶双组分系统的蓝光诱导初步研究

Blue light is one of the most important environmental stimuli that regulate many of the phenomenon of life. By constructing gene library of Cordyceps militaris and using RACE method, histidine kinase gene and blue light receptor gene will be cloned and sequenced. Induced by Blue light, the two-component system of histidine kinase will be studied in Cordyceps militaris. Using northern blot and Western blot method will study the expression of the histidine kinase regulated by blue light. By biochemical methods, histidine kinase activity induced by the blue light will be studied, and histidine kinase functional domains will be analyzed.

蓝光是最重要的环境刺激因素之一，对许多生命现象进行调控。通过基因文库的构建和采用RACE方法对蛹虫草组氨酸激酶基因和蓝光受体基因进行克隆和测序。通过蓝光诱导，研究蓝光对组氨酸激酶双组分系统的影响。研究中，采用了Northern杂交和Western杂交等方法研究了组氨酸激酶受蓝光调控的表达情况。同时采用生化方法研究了蓝光诱导下的组氨酸激酶的活性，并对组氨酸激酶的功能域进行分析。

蓝光可以引起生物体的生理和生化变化；组氨酸激酶（Histidine Kinase, HK）是双组分信号转导系统的重要成分，是真菌感受外界刺激的重要组成部分，使真菌能适应和应答环境的改变。以蛹虫草（Cordyceps militaris）和蝉棒束孢（Isaria cicadae）为研究对象，通过RT-PCR获得蛹虫草组氨酸激酶基因CmHK和蝉棒束孢Isaria cicadae组氨酸激酶基因IcHK的ORF。翻译产物CmHK和IcHK进行生物信息学分析表明存在着4个HAMP功能域、1个HisKA功能域、1个HATPase功能域和1个REC功能域，为典型的组氨酸激酶特征。将蛹虫草菌丝体进行持续的24h蓝光照射， real-time PCR分析了CmHK表达，CmHK在蓝光照射之初表达量明显下降，随后在蓝光持续的照射下有一个震荡上升，并在16h时达到高峰，随后快速下降，这表明蓝光的直接照射可导致CmHK表达水平的改变。采用实时荧光定量PCR方法研究了3种杀菌剂咯菌腈（Fludioxonil）、异菌脲（Iprodione）和克菌丹（Captan）对CmHK和IcHK表达的影响。结果表明，CmHK基因的表达对这3种杀菌剂的影响不敏感，不能导致CmHK基因的相对转录量增加。IcHK基因的表达对这3种杀菌剂的影响敏感，特别是对咯菌腈和克菌丹更为敏感，这3种杀菌剂可导致IcHK基因的相对转录量增加。研究结果表明不同真菌应对相同胁迫环境时，同源基因的表达特征可存在差异。原核表达和化学合成制备了5种CmHK抗原和4种蛹虫草钟蛋白CmFRQ抗原，免疫家兔后获得CmHK抗体anti-CmHK1、anti-CmHK2、anti-HK3、anti-HK4和anti-HK5，获得CmFRQ抗体anti-CmFRQf、anti-FRQ1、anti-FRQ2和anti-FRQ3。Western blotting分析检测到蛹虫草菌丝体中有两条CmHK特异的蛋白杂交带，大小 为85 kDa和45 kDa。Western blotting分析检测到蛹虫草菌丝体和子实体中CmFRQ有100 kDa、50 kDa和31 kDa杂交带。实时荧光定量PCR技术检测不同条件下的钟基因Cmfrq、蓝光受体基因Cmwc-1和Cmwc-2的表达。结果表明，在不同条件下Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表达不同。