蛹虫草菌液体深层发酵生产纤溶酶的诱导、分离纯化及功能性研究

大型真菌蛹虫草具有多种生理功能。天然蛹虫草产量低，资源有限。液体深层发酵收获的蛹虫草菌丝体和发酵液具有与天然蛹虫草相似的功能。本项目组发现蛹虫草菌深层发酵液中含有纤溶酶，已初步建立发酵产酶的培养方法，但目前酶的发酵产量和提纯回收率偏低。本项目用静息细胞培养方法确定蛹虫草发酵产纤溶酶的诱导物，建立蛹虫草菌高产纤溶酶的培养体系；采用扩张床、离子交换、疏水相互作用色谱等方法，创立载量大、速度快、活力回收率高的纯化纤溶酶的方法。在获得较大量的高纯度酶的前提下，应用先进的酶学手段阐明酶的分子量、等电点、反应动力学特征等酶学性质；用生物学相关手段和方法，设计并建立具有血栓倾向的动物模型，在整体动物水平阐明酶的纤溶功能性。本项目的研究可为其它微生物发酵纤溶酶的高产提供借鉴思路，为酶的高效分离提供具有普遍意义的可借鉴方法，为蛹虫草纤溶酶在功能食品或功能性食品基料中的应用奠定理论基础。

血栓疾病威胁人类健康。本项目组发现分离自大兴安岭的食药真菌蛹虫草发酵产生了新纤溶酶。采用静息细胞法确定了发酵产酶关键底物，对产生的纤溶酶进行纯化并建立了高效纯化方法，研究了其酶学性质和体外溶栓抗栓性能，并利用小鼠和大鼠模型研究了酶逆转血栓倾向性能。获得了如下重要结果。.1、用静息细胞法确定了影响该菌发酵产酶关键底物。建立了蛹虫草静息细胞培养法，用该法确定酪蛋白酶解产物对酶具有较强诱导能力；预水解的粗料氮源使产酶周期比未预水解组缩短1d，产酶量提高了2倍。.2、建立了蛹虫草纤溶酶高效纯化方法。顺次用20%硫酸铵盐析，Sephadex G-25凝胶色谱，Phenyl-Sepharose HP疏水色谱，CM-Sepharose FF弱阳离子色谱和Source 15 PHE疏水色谱对酶进行分离纯化，最终纯化后的纤溶酶I比活力1839.35U/mg，总纯化倍数45.81倍，活力回收率17.62%；纤溶酶II比活力1279.58U/mg，总纯化倍数31.87倍，活力回收率10.58%。两种纤溶酶均达到电泳纯。.3、研究了酶的性质。酶I单亚基，分子量32 kDa，等电点9.3，总含糖量0.98% (w/v)，酶I为含巯基的丝氨酸蛋白酶，其最适作用温度及pH分别为37℃和7.4，反复冻融对酶I活力无明显影响，冻干后可在-80℃保存一年以上，Q-TOF2测得酶I的三个肽段氨基酸序列，经比对发现酶I为新酶。酶II单亚基，分子量28 kDa，等电点9.0，含糖量1.668%(w/v)，酶II有与大豆胰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶相似的活性部位，酶II直接降解血纤维蛋白，又有激活纤溶酶原间接降解血纤维蛋白的作用，酶II最适作用温度和pH分别为37℃和7.2。.4、开展了酶逆转血栓倾向试验。分别建立了小鼠和大鼠高脂模型，饮用水中添加6000 U/kg•d的酶可以显著降低其TC、TG和LDL-C水平，同时升高HDL-C水平，有效延长TT、PT、APTT值，同时降低FIB、PAI和PLG含量，升高t-PA含量和PL活性。表明该酶具有降低动物血栓倾向的功能。.5、进行了溶解家兔血栓功能研究。用挂线法建立家兔血栓模型，发现酶显著减轻动脉血栓湿重和干重，缩短了PT、TT值，减少FIB含量，表明蛹虫草纤溶酶具有显著溶栓作用。.本项目研究成果为开发降低血栓倾向功能食品及新型溶栓、抗栓药物奠定了理论基础。