质体型α-葡聚糖磷酸化酶的磷酸化及其对淀粉生物合成起始过程的调控

Plastidial α-1,4-glucan phosphorylase (Pho-1) is an important α-1,4-D-glucosyltransferase that catalyzes the phosphorolysis of the terminal residue from the nonreducing ends of a-1,4-linked glucan chains, liberating Glc-1-P. Although this reaction is reversible, it has been argued that the relatively low levels of Glc-1-P and high levels of inorganic phosphate in plant cells favors the glucan degradation. Recently, Pho-1 has been found to play a pivotal role in the initiation process of rice seed starch biosynthesis, however, the mechanism remains unkown. Protein phosphorylation plays an important role in regulating starch biosynthesis. It has been showed that Pho-1 was phosphorylated during storage starch synthesis and this modification promoted the formation of two complexes: Pho-1/DPE1 and Pho-1/BE1/BEIIb. To date, no other information was available about the phosphorylation sites of Pho-1 and the functions mediated by these modifications. Previously, we have isolated natural Pho-1 from developing rice seeds, and identified six amino acid residues as the phosphorylation sites of Pho-1. In this study, we will focus on exploring the biological functions of the phosphorylation sites of Pho-1 and illustrating the roles of pho-1 phosphorylation in regulating the initiation process of starch biosynthesis. Our research will contribute to revealing the molecular mechanism of Pho-1 in rice starch biosynthesis and to providing a basis for the genetic improvement of rice starch quality.

α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase，Pho）是一种重要的葡萄糖基转移酶，其主要功能是催化淀粉的磷酸解。淀粉合成起始是淀粉生物合成的一个基本问题。质体型Pho（Pho-1）在淀粉合成起始过程中发挥重要作用，其分子机理还不清楚。Pho-1是蛋白激酶的重要靶点。磷酸化的Pho-1能够和质体型D-酶（DPE1）、淀粉分支酶（BEs）组装成磷酸化依赖的Pho-1/DPE1和Pho-1/BE1/BEIIb复合物。目前，Pho-1的磷酸化位点及其生物学功能还未见报道。申请者前期工作鉴定到Pho-1的多个磷酸化位点。本项目拟在此基础上对Pho-1磷酸化位点的生物学功能、磷酸化依赖的Pho-1多酶复合体的生物发生以及Pho-1磷酸化对淀粉合成起始过程的调控进行研究和探讨。本研究对于阐明Pho-1磷酸化调控淀粉生物合成起始过程的分子机制，完善淀粉生物合成的调控网络具有重大意义。

淀粉是水稻种子中最重要的储藏物质。淀粉是葡萄糖的高聚物。麦芽寡糖是淀粉合成起始的最初引发物。α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase，Pho）是一种重要的葡萄糖基转移酶，其主要功能是催化淀粉的磷酸解。Pho有两种：细胞质定位的Pho2和质体定位的Pho1。Pho-1在淀粉合成起始过程中发挥重要作用，其分子机理还不清楚。水稻Pho-1是蛋白激酶的重要靶点。磷酸化Pho-1能够和质体型D-酶（DPE1）、淀粉分支酶（BEs）组装成磷酸化依赖的 Pho-1/DPE1和Pho-1/BE1/BEIIb多酶复合物。目前，Pho-1磷酸化位点及其在淀粉合成起始过程的生物学功能还未见报道。申请者前期工作鉴定到Pho-1的多个磷酸化位点。本项目拟在此基础上对Pho-1磷酸化位点的生物学功能、磷酸化依赖的Pho-1多酶复合体的生物发生以及Pho-1磷酸化调控淀粉合成起始过程的分子机制研究和探讨。本研究纯化了水稻种子Pho-1蛋白，合成了磷酸化的Pho-1肽段，制备了Pho-1磷酸化抗体，免疫分析和体外的磷酸化肽段模拟分析证实了Pho-1磷酸化位点的真实性；构建了模拟Pho-1磷酸化与非磷酸化的两类转基因水稻；制备了Pho-1和DPE1功能缺失的单突变体和双突变体。Pho-1磷酸化增强其淀粉合成能力，促进Pho-1/DPE1多酶复合体的生物发生。转基因表型与代谢物分析表明：Pho-1磷酸化促进MOS动员，加速淀粉合成起始进程，增强淀粉积累与籽粒的灌浆水平。突变体表型与代谢物分析发现：Pho-1与DPE1共同调控淀粉合成起始过程麦芽寡糖的动员。Pho1功能缺失种子在发育早期麦芽寡糖累积，淀粉含量减少；而在发育后期，部分种子麦芽寡糖与淀粉代谢恢复正常。DPE1功能缺失的种子麦芽寡糖水平与淀粉含量与野生型基本相当。Pho1与DPE1双突变导致麦芽寡糖大量累积，而淀粉合成被破坏，产生空的、无淀粉的种子。这些结果进一步揭示：Pho1与DPE1通过控制麦芽寡糖的动员共同调控水稻种子淀粉合成起始过程。本研究结果对于阐明Pho-1磷酸化位点的生物学功能，完善水稻种子淀粉生物合成的调控网络具有重大意义，同时为水稻、小麦和玉米等谷类作物淀粉品质的改良提供新靶点、新思路。