水稻种子淀粉合成过程中α-葡聚糖磷酸化酶的作用机制研究

α-葡聚糖磷酸化酶是一种重要的葡聚糖降解酶。近年来的研究表明，定位于质体中的α-葡聚糖磷酸化酶（Pho-1）在水稻种子淀粉合成中发挥着重要作用，然而，其作用机制仍不清楚。本研究紧紧抓住Pho-1的磷酸化修饰和磷酸化的Pho-1能够与淀粉分枝酶BEI和BEIIb形成多酶复合体这一线索，利用生物化学、分子生物学和质谱学等手段，解析水稻Pho-1的磷酸化位点，研究磷酸化修饰对Pho-1催化淀粉合成功能的影响；同时，采用荧光蛋白标记技术和遗传转化途径，在水稻种子中构建荧光共振能量转移系统，探讨淀粉体中Pho-1多酶复合体发生与累积的规律，以期揭示Pho-1调控水稻种子淀粉生物合成的动态进程。本研究对于阐明Pho-1调控水稻种子淀粉生物合成的作用机制，完善水稻种子淀粉生物合成的调控网络具有重大理论意义；另一方面，也为利用生物工程技术改良稻米的淀粉品质提供理论依据，具有潜在的重大应用价值。

α-葡聚糖磷酸化酶是一种重要的葡聚糖降解酶。然而，定位于质体中的α-葡聚糖磷酸化酶（Pho-1）在水稻种子淀粉合成中发挥着重要作用，但是其作用机制仍不清楚。本研究采用多种蛋白纯化手段，从水稻种子总蛋白中分离出高纯度的天然Pho-1蛋白。纯化的Pho-1蛋白，经胰酶消化和磷酸肽段的富集后，利用液相色谱－串连质谱（LC-MS/MS）鉴定到6个内源的磷酸化残基位点：S64，S377，S542，S560，S672和T897。这是国际上首次报道淀粉合成相关酶类磷酸化修饰的鉴定结果。非变性胶/酶活性分析和Co-IP表明，Pho-1磷酸化修饰与其淀粉合成功能密切相关。将pho-1编码磷酸化残基的密码子突变为丙氨酸（模拟永久非磷酸化）和天冬氨酸或谷氨酸（模拟永久磷酸化）的密码子，构建植物表达载体，转化pho-1突变体，获得了一系列转基因水稻植株。我们发现其中1个位点的磷酸化修饰能够恢复pho-1突变体淀粉粒的晶型结构，而该位点非磷酸化的Pho-1则不能，提示该位点的磷酸化是Pho-1参与水稻淀粉合成的关键因子。这些发现对于阐明Pho-1调控水稻种子淀粉生物合成的分子机制，完善水稻种子淀粉生物合成的调控网络具有重大理论意义。