益气活血方干预DTL泛素蛋白酶途径抗NSCLC的分子机制研究

According to the YiQiHuoXue therapy, we found an effective component formula with the anti-NSCLC function, which was named YiQiHuoXue Recipe(YHR). Our preliminary study found that E3 ubiquitin ligase substrate receptor DTL is closely related to the progression of NSCLC. DTL promotes ubiquitination of the PDCD4, which is the inhibit factor to JNK signaling pathway, and then activates JNK signaling pathway. Moreover, YHR significantly inhibits the expression of DTL. Based on these findings, we made a hypothesis: YHR could inhibits the functional signaling pathways through targeting DTL ubiquitin protease pathway, that is an important part of the specific anti-NSCLC effect. According to this hypothesis, We will study the effect of YHR to the biological behaviors by MTT, HCS, RTCA in DTL highly expressed stable cell lines, DTL silencing stable cell lines and DTL knockout homozygous mice. Then, we will verify that YHR could inhibits the biological behaviors of NSCLC targeting DTL. To analyze the relationship between YHR and DTL, we will detect by BLI，CO-IP. For drug-targeted signaling pathways, we will study the ubiquitin level of PDCD4 and the activity of DTL related signaling pathway. These researches provide mechanistic insight into the anti-NSCLC of YHR by targeting DTL ubiquitin protease pathway. These ideas and methods of the research are innovative. Also, the project is innovativeness at source.

益气活血方是我们前期研究获得的具有特异性抗非小细胞肺癌（NSCLC）作用的有效组分复方。我们新近研究发现，E3泛素连接酶底物受体DTL靶向JNK信号通路抑制分子PDCD4，促使PDCD4泛素化降解，进而活化JNK信号通路，促进NSCLC发展；益气活血方可显著抑制NSCLC细胞DTL表达。据此提出假说“益气活血方干预DTL泛素蛋白酶途径，抑制JNK信号通路活性，是其抗NSCLC的重要环节”。围绕假说，本项目拟通过构建DTL稳定高表达、沉默的细胞系和DTL基因敲除纯合小鼠，应用免疫荧光高内涵细胞分析技术等，研究益气活血方对NSCLC生物学行为的影响，验证其对DTL的靶向作用；进而应用生物膜偏振技术、免疫共沉淀等，检测药物与DTL分子间相互作用、对PDCD4泛素化水平和JNK通路活性的调控作用，揭示益气活血方经DTL泛素蛋白酶途径抗NSCLC的分子机制。研究思路和方法有创新，并具源头创新性。

益气活血方是我们研究获得的具有特异性抗非小细胞肺癌（NSCLC）作用的有效组分复方。本项目通过体内外实验，从细胞、基因、蛋白水平，以DTL介导的泛素蛋白酶途径阐明益气活血方特异性抗肿瘤作用的分子机制。项目按照计划主要开展的研究工作如下：1)益气活血方对非小细胞肺癌(NSCLC)生物学行为的影响；2)益气活血方与靶蛋白DTL的相互作用关系；3）益气活血方对DTL相关泛素蛋白酶途径相关信号通路的调控作用；4)筛选益气活血方中通过DTL泛素蛋白酶途径抗NSCLC的有效成分，优化配伍并验证；5) 益气活血方中有效成分配伍FMG-Ⅱ通过精准干预DTL介导PDCD4泛素化影响相关信号通路抗NSCLC关键效应机制。本项目研究明确了益气活血方通过DTL干预 NSCLC 恶性生物学行为的作用途径，确定DTL为益气活血方抗NSCLC的药物新靶点蛋白，进一步筛选获得益气活血方中靶向DTL抗NSCLC的有效成分配伍FMG-Ⅱ，揭示益气活血方中有效成分配伍通过精准干预DTL，阻滞PDCD4泛素化降解，抑制MAPK/JNK信号通路作用，从而发挥抗 NSCLC效应。项目执行期间，在《Cancer Research》、《Pharmacological Research》等国际高水平杂志上已发表标注本基金的论文10篇，其中SCI 9篇，CSCD-C 1篇，申请专利1项，先后荣获江苏省“青年五四奖章”提名奖（2021），中国中西医结合学会科学技术奖二等奖（第1完成人，2022），江苏中医药科学技术奖一等奖（第1完成人，2022），培养及协助培养研究生6人，其中博士2人，硕士4人。本项目对传统中医药研究方法进行拓展和延伸，探索运用更深层次的生物医学方法研究益气活血治法方药干预蛋白翻译后修饰，注重中医临床经典与科技前沿的深度交叉，为以现代学术语言阐释中医药科学内涵，为治则治法、方药配伍等相关创新研究提供思路与方法。