反向遗传学技术研究卫星病毒对罗氏沼虾野田村病毒复制及致病性的影响

Macrobrachium rosenbergii nodavirus(MrNV) is a ssRNA virus and always associated with a non-autonomous satellite-like virus(XSV).AS the 3rd animal satellite virus, the mechanism for interaction of XSV and MrNV is unclear. To disclose the exact replication mechanism of MrNV and XSV, severa major issues as following will be finished in the future: (1) Using reverse genetics technology, the cloned virus of MrNV/XSV-chin is obtained by gene transcription in vitro;(2)At the cellular level and living level, the mechanisms of interaction of XSV and MrNV will be analyzed in the replication and pathogenicity;(3) siRNA of XSV-chin is designed and synthesized by RNA interference technology, which is to further analysis the molecular mechanism of whether the replication of XSV is rely on MrNV.(4)The immune protective effect of XSV-siRNA is evaluated for MrNV. According to the above research, we expect that the replication mechanism of XSV and MrNV will be elucidated, and it also laid the soid foundation of the study of infection mechanism, the immune antigen molecules and the drug therapy.

罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）是一种ssRNA病毒，其伴生有一种卫星病毒（XSV），作为第3个被发现的动物卫星病毒XSV与辅助病毒MrNV之间的相互作用机制尚不清楚。因此本项目拟研究①采用反向遗传学技术，通过体外基因转录获得MrNV/XSV-chin的拯救病毒；②在细胞水平和活体水平上进行攻毒试验，分析两种病毒在复制与致病性的相互作用机制；③利用RNA干扰技术设计与合成罗氏沼虾野田村病毒伴生卫星病毒（XSV-chin）siRNA，进一步分析XSV依赖于MrNV的分子机制；④通过目的基因XSV的siRNA产物免疫罗氏沼虾来确定是否能够提高宿主的抗病毒能力，对免疫保护作用进行评估。XSV与MrNV在复制及致病性上相互关系的研究，为逐步阐明罗氏沼虾野田村病毒的致病机理、获得免疫抗原分子及药物治疗奠定基础。

罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）是一种ssRNA病毒，其伴生有一种卫星病毒（XSV），作为第3个被发现的动物卫星病毒XSV与辅助病毒MrNV之间的相互作用机制尚不清楚。因此本研究项目按照预定的研究目标，首先针对罗氏沼虾野田村病毒中国株，采用RACE技术进行了病毒全基因组克隆，完成了罗氏沼虾野田村病毒RNA1和RNA2基因的全长克隆，成功地连接到经改造的pFastBacHTB载体上，在昆虫sf9细胞上进行了成功转染，利用CP43抗体进行了免疫荧光观察；在细胞和活体水平上比较了MrNV与XSV的转录表达水平，发现在感染早期XSV的表达水平明显高于MrNV；成功筛选到病毒siRNA产物，在细胞sf9中进行主病毒与卫星病毒的干涉试验，采用荧光定量PCR实验验证，结果表明在MrNV 编码聚合酶基因RNA1沉默的情况下，会导致XSV复制抑制，而编码衣壳蛋白基因RNA2沉默时，XSV复制无明显影响；对XSV衣壳蛋白基因CP17干涉时则对MrNV复制无显著性影响；采用二维电泳-质谱联动检测技术对罗氏沼虾淡化后幼体在MrNV与XSV感染后的差异蛋白进行筛选分析，初步筛选到差异表达蛋白77个，其中差异极显著蛋白斑点35个，进行质谱分析，已鉴定出19个；对MrNV和XSV感染前后罗氏沼虾幼体进行转录组测序分析，发现显著差异性表达基因161个，其中上调基因30个，下调基因131个；因在细胞水平进行XSV干涉试验表明对MrNV复制影响有限，从而在细胞水平构建了一种抗病毒免疫增强剂筛选方法，进行抗病毒免疫分析，筛选出罗氏沼虾免疫相关显著下调miRNA共计8个，经microRNA荧光定量PCR验证，确定bta-mir-2478、mu-mir-3968和has-mir-7975三个小RNA可用于罗氏沼虾免疫效果评估。通过项目实施已发表SCI论文2篇，核心期刊论文1篇，申请专利4项，已获得授权发明专利2项，较好的完成了项目计划内容及各项任务指标。