糖尿病肾病尿样中糖基化蛋白质组学的研究

糖尿病肾病是由于糖尿病长期血糖增高造成的肾脏损害,随糖尿病患者的增加，它已成为全球性健康问题。但由于与之相关的生物标记物尚未发现，无法对其进行早期诊断和防治。肾脏的主要功能之一是形成原尿，而尿液中蛋白的种类和数量与肾脏健康程度有着直接的联系。尿液是唯一能够在无创伤条件下大量获得，并与人体健康情况直接相关的体液，对其进行蛋白质组学研究具有非常重要的意义。本课题以糖尿病肾病患者尿液为研究对象，通过"散弹枪"蛋白质组学研究策略对尿液中的N-糖基化蛋白进行研究，分离并鉴定尿液中N-糖基化蛋白；并对不同病症期的糖尿病肾病患者尿液中的N-糖基化蛋白进行差异蛋白质组学的研究，寻找存在显著性变化的N-糖基化蛋白，并以这些N-糖基化蛋白为基础，采用免疫印迹的方法对它们进行验证，寻找潜在的生物标记物，探寻糖尿病肾病致病机理，建立糖尿病肾病早期预警机制。

糖尿病肾病是由于糖尿病长期血糖增高造成的肾脏损害,随糖尿病患者的增加，它已成为全球性健康问题。但由于与之相关的生物标记物尚未发现，无法对其进行早期诊断和防治。肾脏的主要功能之一是形成原尿，而尿液中代谢产物以及蛋白质的种类和数量与肾脏健康程度有着直接的联系。尿液是唯一能够在无创伤条件下大量获得，并与人体健康情况直接相关的体液，对其进行代谢组学与蛋白质组学研究具有非常重要的意义。本课题以糖尿病肾病患者尿液为研究对象，收集正常人、糖尿病（T2DM）和不同病期糖尿病肾病患者（DN）有效尿样近150份，与临床诊断结果为依据，对所收集的样品进行归类，对尿液中的代谢小分子化合物和糖基化蛋白进行系统分析，具体工作如下：.1. 基于单个样本和合并样本策略的GC-MS方法分析了23例T2DM患者和29例正常人。所得数据采用t-Test，主成分分析（PCA）及偏最小二乘法(OPLS-DA)，从单样本分析策略中筛选出糖尿病潜在的标志物有19个，从合并样本策略中寻找到29个，而结合单个样本和合并样本策略方法中分析得到了10个T2DM的潜在标志物。经文献报道和数据库验证这10个潜在标志物均与T2DM有直接的关系；.2. 基于GC-MS的单样本和合并样本方法对41例DN1早期、21例中期、23例晚期和29例正常人的尿液进行了分析，共鉴别出88个化合物。分别采用t-Test, PCA和OPLS-DA对GC-MS数据进行处理,筛选出13个具有显著性差异的DN生物标志物，并对其在不同病理时期的变化进行了研究；.3. 对正常样品19例，DN早期样品21例，中期17例，晚期18例尿样样品进行LC-MS/MS分析。通过肼化学方法富集糖基化蛋白，散弹枪策略进行分析，label free方法相对定量，以OSC-PLS-DA寻找潜在标志物。实验结果表明，25个糖基化蛋白在DN中异常表达，其中11个蛋白随DN病情的发展持续上调，4个持续下调，10个则呈现波动变化的趋势。分析结果用免疫印迹的方法进行了验证，结果与质谱结果一致，其中6种糖基化蛋白在DN中首次发现具有表达差异；.4. 建立了糖尿病肾病常用药物、四种常见的非蛋白氮物质等小分子化合物高效液相色谱、气相色谱-质谱联用检测方法，为评价糖尿病中的小分子化合物的种类和含量提供了可靠的手段。