纳升级糖基化蛋白分离材料的制备及其在蛋白质组学中的应用

蛋白质翻译后修饰(Post Translational Modifications, PTMs)是影响蛋白质结构和功能的重要因素，在生物化学调控途径中起着重要作用。然而在生物体内糖基化蛋白在数量上和动态范围内都存在着极大波动，且同时存在着大量非翻译后修饰蛋白的干扰。如何有效消除这些干扰，是目前糖基化蛋白质组学研究的难点。本项目拟采用金属螯合机理研制可控多凝集素纳升级亲和柱，在具有生物兼容性的毛细管整体微柱材料上，衍生一定官能团。通过螯合作用固载金属离子，改变金属离子的种类和比例，将二种或二种以上的凝集素可控地固载于固定相表面，从而可代替传统微球型凝集素亲和材料，应用于血浆、组织、器官等微量生物样品中。利用所固载的二种或二种以上凝集素，可实现对多种结构的糖基化蛋白同时富集，达到高效率、高选择性、高特异性的目的，提高糖基化蛋白鉴定的数量、代表性和可信度，为疾病蛋白质组学研究提供新的技术手段。

糖基化蛋白质翻译后修饰是影响蛋白质结构和功能的重要因素，在生物化学调控途径中起着重要作用。然而在生物体内糖基化蛋白在数量上和动态范围内都存在着极大波动，并存在着大量非翻译后修饰蛋白的干扰。如何有效消除这些干扰，是目前糖基化蛋白质组学研究的难点。针对于此，本项目制备系列功能化磁性纳米微球（MNPs），用于复杂生物样本中糖基化蛋白/肽的高选择性高特异性富集，具体包括：（1）基于水热反应原理，制备了传统核壳结构表面修饰有氨基、硅包覆的NH2-MNPs；基于水热反应原理，采用“一锅法”合成1,6-己二胺功能化HMD-MNPs；基于共沉淀反应原理，采用“一锅法”合成了乙二胺四乙酸功能化EDTA-MNPs。基于螯合机理，以Cu(II)为桥基，将伴刀豆球蛋白（Con A）固载于MNPs表面，成功制备出具有稳定“三明治”结构的吸附材料。Con A固载量分别可以达到20 wt%、23 wt%、28 wt%。其对糖蛋白的选择性和特异性均已达到或超过了已报道的同类材料水平。同时发现载体上螯合配体数量越多，碳链越长，所得材料的选择性和特异性越高。实验结果证明基于螯合机理固载凝集素的磁性纳米材料具有稳定的结构，持久的磁响应性和良好的分散性。与常用的化学键和物理吸附等固载方法相比，本方法制备工艺简单、固载条件温和，可保持凝集素空间结构及生物活性。（2）采用“一锅法”一步成功制备壳聚糖包覆的磁性胶质纳米晶簇（Fe3O4@CS MCNCs）。并采用TG、SEM、Zeta电势、元素分析和磁滞曲线分析对其进行表征。该材料同时具有由晶簇表面的壳聚糖提供的强亲水性和传统磁性微球的特性，将之应用于标准糖基化蛋白质酶解物中糖肽的富集，表现出高选择性、低灵敏度（< 8 fmol）、高富集容量（35 mg/g）以及快速分离等优良性能。将其应用于复杂样品Hela细胞，从45 μg蛋白提取液共鉴定出175个糖基化蛋白（283个糖肽）。与传统四步法相比，该方法操作简单，经济。（3）制备出具有多孔镂空结构的新型磁性分子印迹聚合物微球，其比表面积可以达到511.30 m2/g。将之应用于梨汁中吲哚丁酸的富集，在三个浓度水平，加标回收率为75.54-87.92%，相对标准偏差小于2.94%。