卵源性生长因子GDF-9和BMP-15基因突变与卵巢衰老相关机制研究

卵巢功能是关系到女性生殖生理和生殖健康的一个根本问题。GDF-9、BMP-15是近年发现的对卵泡发育及卵巢功能有重要调控作用的卵巢局部旁分泌自分泌因子。近年研究显示多囊卵巢综合征及卵巢早衰患者GDF-9、BMP-15基因存在突变位点，提示我们GDF-9和BMP-15基因的异常将会干扰女性卵泡发育和卵巢功能。本实验室首次发现GDF-9/BMP-15基因的一些突变位点参与了卵巢储备功能下降（即卵巢衰老）的发生。但是，GDF-9/BMP-15基因突变是如何参与卵巢功能的调节?我们设想：GDF-9和BMP-15错义突变导致蛋白加工、分泌过程异常，影响蛋白水解酶的水解，从而造成有活性的成熟蛋白无法分泌或分泌量下降，最终干扰了蛋白的活性和生物学功能。拟通过克隆GDF-9和BMP-15cDNA，构建野生型和突变型GDF-9和BMP-15质粒，探讨GDF-9及BMP-15基因突变与女性卵巢衰老的相关机制。

生长分化因子9（GDF-9）、骨形态发生蛋白15（BMP-15）是近年发现的对卵泡发育及卵巢功能有重要调控作用的卵巢局部旁分泌自分泌因子。本实验室对卵巢储备功能不良女性进行GDF-9及BMP-15基因筛查，分析其SNPs与卵巢储备功能下降的关系，发现GDF-9/BMP-15基因的一些突变位点参与了卵巢储备功能下降（即卵巢衰老）的发生：其中GDF-9 G546A(p.R146C)、BMP-15 C599T(p. H200Y)与女性卵巢储备功能不良密切相关，但其机制不明。遂拟通过克隆GDF-9和BMP-15cDNA，构建野生型和突变型GDF-9和BMP-15蛋白，探讨GDF-9及BMP-15基因突变与女性卵巢衰老的相关机制。. 我们顺利完成了GDF-9基因突变导致女性卵巢功能的衰竭的机制研究部分实验，成功克隆了人GDF-9基因，构建了人GDF-9的野生型表达质粒以及GDF-9 pD57Y和GDF-9p.R146C突变型表达质粒；并获得重组的野生型和突变型GDF-9蛋白。进一步研究发现野生型蛋白可以刺激颗粒细胞增殖，并呈浓度依赖性，GDF-9 pD57Y具有与野生型蛋白相似的活性，而GDF-9p.R146C对颗粒细胞的刺激作用显著减弱。更进一步分析GDF-9下游的信号通路发现，野生型蛋白和GDF-9 pD57Y均可以启动Smad2的磷酸化水平，而GDF-9p.R146C对Smad2磷酸化的诱导作用极其微弱。这可能是GDF-9p.R146C生物学功能下降的原因。在BMP-15蛋白重组实验中，我们成功获得了BMP-15野生型和H200Y突变型（C599T）、突变型（A705G）的表达质粒，但由于目的蛋白表达过低无法纯化，无法进一步开展功能实验。遂在课题经费允许的情况下，开展了BMP-15临床样本研究：对低反应患者卵泡液BMP-15水平进行了测定，并发现卵泡液BMP-15水平较高的患者胚胎种植率、化学妊娠率、临床妊娠率、活产率显著高于BMP-15水平较低的提示患者，BMP-15可能在低反应患者助孕方案的选择中发挥作用。. 本项目按计划完成，并发现，GDF-9p.R146C因对Smad2磷酸化的诱导作用降低导致对颗粒细胞的刺激作用显著减弱，这一重要变化可能是女性卵巢功能过早衰退的机制之一。卵泡液BMP-15水平对于预测低反应患者IVF-ET结局有重要的参考意义。