基于炎性单核细胞探讨TLR4在糖尿病状态下牙周组织炎症中的作用研究

Although periodontitis has been considered as the sixth complication of diabetes, the exact mechanism that diabetes contributes to the development of periodontitis is not fully understand. In our previous study, we had confirmed that high-glucose environment induced Toll like receptor 4 expression and resulted in the hyper-response to LPS in gingival epithelium which demonstrated by the high expression of CCL2, IL-6, IL-8, and so on. Our findings suggested that high glucose causes a direct increase of TLR4 expression in gingival epithelium, which may promote the susceptibility of periodontitis for subjects with diabetes. Recently, inflammatory monocyte, a new subgroup of monocyte, had been found to be recruited by CCL2 and play a critical role in a series of disorders. Therefore, we will further study the critical roles of “TLR4-CCL2-inflammory monocyte pathway” in the pathogenesis of low grade inflammation of periodontal tissue in diabetes rat in vivo and vitro. After that, we will explore the possibility and effect of prevention and treatment of periodontitis based on the blockade of TLR4 in diabetes rats.

尽管牙周炎已被公认为糖尿病的六大并发症之一，然而对于糖尿病如何促进牙周炎发生发展的机制仍未明确。申请人在前期研究中证实，高糖状态下TLR4介导了牙龈上皮细胞的LPS高反应性，其中CCL2是表达升高最为显著的细胞因子之一，我们的研究结果直接提示TLR4在糖尿病伴牙周炎的发生发展中发挥着重要作用。炎性单核细胞是新近确认的单核细胞亚群，研究已经证实CCL2可通过募集炎性单核细胞参与多种疾病的发生发展。因此，本项目在前期研究基础上，结合免疫学最新研究进展，拟采用体内外实验进一步明确TLR4-CCL2-炎性单核细胞路径在糖尿病大鼠牙周组织低度炎症状态形成中的作用，并探讨TLR4作为糖尿病大鼠牙周炎防治靶点的可行性及有效性。本项目预期可阐明TLR4促进糖尿病患者牙周炎发展中的作用及其机制，并为今后开展以TLR4为靶点临床相关研究提供初步的研究依据。

糖尿病与牙周炎之间相互关系十分密切，不仅表现在糖尿病可促进牙周炎的发病，亦可表现在牙周炎可影响糖尿病的病情，但二者相互影响的机制并未明确。课题组前期研究中发现高糖状态下TLR4介导了牙龈上皮细胞的LPS高反应性，本项目是基于此重要发现提出TLR4-CCL2-炎性单核细胞路径在糖尿病促进牙周炎症中具有重要作用这一科学假说，在此基础上进一步探讨TLR4作为糖尿病伴牙周炎防治靶点的可行性及有效性。为此，课题组在成功建立糖尿病复合牙周炎动物模型的基础上，通过IHC 及实时荧光定量 RT-PCR 、多因子检测芯片、ELISA等方法检测大鼠牙周组织中 TLR4 及炎症因子（IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α、NF-κB p65等）的表达差异；免疫荧光、RT-PCR等方法检测牙周组织中 CCL2、CCR2、CD14、CD16等的表达，评估小鼠模型中CD11b+Ly6c+ 炎性单核细胞及人牙周病损样本中CD14+CD16+ 炎性单核细胞浸润情况；Micro-CT 评估大鼠模型中牙槽骨的吸收情况。研究发现，糖尿病伴牙周炎病损中CCL2等因子较单纯牙周炎及对照组显著增高，并呈现更高密度的炎性单核细胞浸润及更严重的牙槽骨吸收想象。据此，我们进一步明确了TLR4-CCL2-炎性单核细胞路径在糖尿病促进牙周炎发展中的作用。在此基础上，课题组采用TLR4靶向抑制剂TAK242阻断TLR4-CCL2-炎性单核细胞路径，通过检测牙周组织炎症因子及牙槽骨吸收水平变化，以此评估TLR4作为糖尿病伴牙周炎防治靶点的可能性。研究结果表明：TAK242可有效降低糖尿病伴牙周炎病损中CCL2等因子表达水平，同时可有效抑制牙槽骨的吸收，提示TAK242具有治疗糖尿病伴牙周炎的巨大潜能。本项目研究成果可为今后开展靶向干预TLR4防治伴糖尿病的牙周炎临床相关研究提供初步的研究依据，具有较明显的临床应用前景。