七叶一支花内生菌（真菌和放线菌）单培养和共培养选择性抑制肝癌细胞活性次级代谢产物研究

The hepatocellular carcinoma(HCC) is one of the highest incidence in China, more ten times than west countries, and the number of the patients death for hepatocellular carcinoma in China is 50% of the total number in global. Average survival time is 3 - 4 months for the patients with inoperable HCC, and the ratio of average 5-years survival time in developing countries is only 5%. There was no effective drug treatment to HCC, and no drug was permised to treat the HCC in clinical by FDA until now. During the searching the active metabolites of the endophyte from the endangered plants around Shennongjia District, we found a strain actinomycete with selective inhibiting the liver cancer cells in vitro with IC50 at 14.21μg/ml , but other two fungi and three actinomycetes with the same origin showed no selective cytotoxicty to A549,Hep G2, MCF-7 and Caski cells. Thus this project plan is to isolate the active metabolites with selective inhibiting to HCC cells from the mono/co-cuture endophytes-two endophytic fungi and four endophytic actinomycetes from Paris Polyphylla sm.,which will diclose the mechanisms of HCC how to happen and the active metabolites how to inhibit the liver cancer cells, and supply the detailed data in theory and experimnet at the same time.

我国肝癌发病率位居世界前列，是西方国家10倍以上，每年死于肝癌的患者占全球的50%，不能手术肝的癌患者平均存活时间只有3～4个月，而发展中国家肝癌的5年存活率平均仅为5%；肝癌迄今还处于一种严重缺乏有效治疗药物阶段，美国食品与药品管理局(FDA)也没有正式批准一个药物用于临床治疗肝癌。在前期工作基础上从濒危植物七叶一支花中筛选到一株具有具有选择性抑制肝癌细胞活性的放线菌，其粗提物对肝癌细胞的IC50值为14.21μg/ml，而对肺癌，乳腺癌，宫颈癌等细胞没有明显的细胞毒活性，而其它三株放线菌和两株真菌没有选择性，同时对肝癌和肺癌细胞都有一定的细胞毒性。因而本项目拟以七叶一支花的两株内生真菌和四株内生放线菌用单培养和共培养的方式来寻找天然选择性抗肝癌活性物质，不仅具有揭示肝癌发生的可能机制，阐明天然活性物质抑制肝癌细胞的机制等重要的理论意义，同时为新的抗肝癌药物开发提供详实的实验和理论依据。

植物内生菌寄生在植物组织中，在长期的进化过程中形成了长期，动态，互助的密切关系，植物内生菌就像植物的第二套免疫系统一样，为其宿主提供诸多便利，因而通过采自同一植物的内生菌在室内进行单培养和共培养研究，有助于快速发现新的活性先导化合物。整个项目如期完成，从两株真菌和两株放线菌及真菌与放线菌共培养中得到次级代谢产物102个，其中鉴定了80个，包括21个新化合物及6个首次从自然界获得的化合物；A.从结构分类上，80个化合物中含有聚酮类化合物40个，生物碱类化合物30个，萜类化合物10个；在21个新化合物中有两个新骨架化合物，分别为Chinoterpenoid A（新骨架倍半萜）和 Penicitroamide（新骨架含二环[3.2.1]桥环生物碱），还包括7个含N→O配位键酰胺类结构的Penioamideoxidin A-G，是首次从自然界中发现此类结构，并推导其可能的生源合成关系；还得到5个含AB环变形的奇特甾体类化合物22 - acetylisocyclocitrinol A和 Neocyclocitrinol A-D；对部分结构进行了TDDFT理论计算的方法确定其绝对构型，特别是邻二醇类结构；B. 在活性上，从放线菌S1中找到抗肺癌活性的先导化合物Citrinin H1，Bostrycin在体外的HeG2细胞水平的IC50分别为0.85 和1.05 μg/mL；而新化合物8-O-β-D-glucopyranosyl-6- methyl-1-carboxylic methyl ester xanthone和4'-galtacopyranoside djalonensone的对A549细胞IC50 分别为6.8和7.2 μg/mL；部分化合物由于量相对较少，对新化合物Peniopyranone，Penicitroamide，Penioamideoxidin A-F采用虚拟筛选，确定其可能的作用靶标，Peniopyranone的可能作用靶标为CDK2蛋白和乙酰胆碱酯酶；Penicitroamide，Penioamideoxidin A-F的可能作用靶标为乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶A及B，由于条件限制，有待于验证；C. 从真菌F2与放线菌S1共培养发现新化合物7个含N→O配位键酰胺类结构的Penioamideoxidin A-G，共培养是一种有效的寻找新活性先导化合物的方法。