抑癌作用基因PTPRD抑制低氧应激反应及其调控机制的研究

Deletion, somatic mutation and/or epigenetic inactivation of protein tyrosine phosphatase receptor delta（PTPRD） have been reported to occur frequently in several malignancies such as lung adenocarcinoma, glioblastoma and colorectal cancer, suggesting it's a tumor suppressor gene. However, the mechanisms underlying its tumor suppressive role remains elusive. In our preliminary data, restoring wildtype (Wt) PTPRD to several PTPRD-deficient cancer cell lines suppresses the cell proliferation and survival significantly under hypoxia stress condition, however, does not do so under normoxia condition. Together with other evidence, we propose that PTPRD is an important regulator that modulating hypoxia energy stress responses, through which PTPRD exhibit its tumor suppressive role in vivo. The overall goal of our project is to clarify the mechanisms by which PTPRD regulates hypoxia stress response in cancer cells at cellular and molecular level. Our specific aims include: 1. To establish the Wt PTPRD restoration models in various PTPRD-deficient cancers and knockdown models in cancers with Wt PTPRD expression and to examine the capacity of PTPRD in suppressing cell survival and tumorigenicity under hypoxia stress. 2. To assay the effects of PTPRD on cell metabolism, autophagy, apoptosis and cell cycle under hypoxia and determine the major biological processes that are involved. Meanwhile, using biased and unbiased method to assay key signal pathways mediating hypoxia stress responses including HIF1-α, mTOR, AMPK and unfolded protein response (UPR) and determine the major molecular mechanisms involved.3.To further examine how are the mechanisms at cellular and molecular levels are correlated and determine through which key signaling transduction mechanism5 that PTPRD exhibit its capability in affecting specific biological processes under hypoxia stress. Our research should provide insights into tumor suppressive mechanisms of PTPRD and may suggest PTPRD as a new cancer diagnosis endpoint and suggest new approaches to cancer treatment that bear PTPRD alterations.

众多的肿瘤如肺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌等中均发现了较高频率的酪氨酸磷酸酶受体PTPRD的缺失、突变或基因甲基化失活。PTPRD已成为最具潜力的抑癌基因研究对象之一，但抑癌机制不明。前期工作中，我们发现PTPRD在低氧而非正常氧浓度下显著抑制肿瘤细胞生长。因此，PTPRD极有可能通过抑制肿瘤低氧应激反应机制发挥其抑癌作用。为阐明这一机制，首先，我们将建立肿瘤的PTPRD重建表达及基因敲弱模型，并在多个细胞模型中确立PTPRD在低氧环境中的抑癌作用。其次，我们将在低氧环境下研究PTPRD对肿瘤细胞代谢、自噬及凋亡的影响，以及分子水平对HIF1α，mTOR，AMPK及UPR等关键反应调节通路的影响。最后，将综合细胞和分子水平的结果，深入研究其调控分子和细胞机制间的联系。对PTPRD调控低氧应激反应这一新的抑癌机制的阐明，将促进对肿瘤发病机理的了解，为肿瘤分子病理分型及个体化治疗提供新的理论依据。

众多的肿瘤如肺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌等中均发现了较高频率的酪氨酸磷酸酶受体PTPRD 的缺失、突变或基因甲基化失活。PTPRD 已成为最具潜力的抑癌基因研究对象之一，但PTPRD的抑癌机制尚不明朗。. 本研究围绕以下几方面主要内容展开：通过病毒包装感染建立PTPRD敲弱或再表达的稳定细胞系。在正常及低氧浓度下比较PTPRD敲弱与对照肿瘤细胞系的增殖、凋亡、自噬特性。通过定量PCR及蛋白免疫印迹法研究比较PTPRD在低氧而非正常氧浓度下对相应信号通路的影响及变化，通过对代谢通路能量物质浓度的测定研究PTPRD对低氧条件下乳酸代谢途径的调控。通过质谱方法找出PTPRD的去磷酸化底物及相互作用蛋白。 .我们的研究结果包括：.1）.包装慢病毒并建立了包括 A549、H460、293T等的PTPRD敲弱细胞系。成功的包装逆转录病毒并建立了PTPRD再表达的H23、SKMG3等PTPRD稳定细胞系。.2）.低氧浓度下观察发现PTPRD再表达的H23细胞对生长有显著的抑制作用，对细胞凋亡及死亡有促进作用。PTPRD再表达的SKMG3细胞对生长无显著的抑制作用，对凋亡及死亡无明显促进作用。PTPRD敲弱对A549、H460，293T细胞比对照组肿瘤细胞系有显著促生长作用，对细胞凋亡及死亡有抑制作用。PTPRD在本研究中大部分肿瘤细胞系中，有生长抑制作用和促进凋亡的作用。.3）.PTPRD敲弱的A549细胞低氧条件下糖酵解途径7个基因（HK-2, LDHA,PKM2,PFKFB3,.Glut1, PDK1,PGK1）表达上调，PTPRD敲弱的293T细胞pErk及pMek磷酸化增强，pStat3未见明显变化。PTPRD敲弱的293T,H460细胞自噬蛋白LC3-II增强，提示PTPRD在低氧条件下抑制细胞自噬的作用。.4）.通过在正常及低氧浓度下对代谢通路能量物质浓度的测定研究PTPRD对低氧条件下代谢途径的调控。PTPRD敲弱的A549细胞乳酸代谢产物减少，提示PTPRD促进糖酵解代谢途径。.5）.通过质谱研究发现，PTPRD相互作用蛋白可能为ATP5B等线粒体有氧磷酸化代谢相关蛋白。.本研究发掘了抑癌作用基因PTPRD的抑癌机理与低氧及细胞代谢相关，即在正常氧浓度能量状态下并不抑制细胞生长，而在低氧能量状态下抑制细胞增殖，抑制自噬，促进凋亡及细胞死亡，并调控肿瘤代谢。