狂犬病病毒感染导致神经功能异常的机制研究

尽管已有文献对狂犬病病毒（RV）感染导致神经功能异常的机制从病毒和神经元超微结构、神经功能相关基因和蛋白表达水平等进行了研究，但尚未得出明确结论。在筛选到24个与神经功能相关的差异表达基因并证实RV可体外感染去甲肾上腺素能神经元等前期研究的基础上，本项目拟应用RV固定毒株/街毒株通过脑内/外周感染小鼠，采集发病期脑组织，研究不同毒株、不同接种途径对RV感染的区域、神经元类型及神经元超微结构的影响；取RV主要感染区域，研究神经递质受体结合力、神经功能相关基因和主要蛋白的变化；对神经元所发生的变化在原代神经元上进行验证，并结合脑内主要神经核/皮质的定点注射，分析RV感染区域与神经症状间的联系。本项目的创新之处在于将RV感染的脑组织区域、神经元类型、受体结合力、神经功能相关基因及蛋白的表达变化等综合分析，试图通过发生变化的神经元所支配的区域及其功能改变来解析RV感染导致神经功能异常的机制。

狂犬病是一种高度致死性的人兽共患传染病，但其神经致病机制尚不清楚。为此，本项目对狂犬病病毒(RABV)株的特性、感染的神经元类型、感染区域、糖蛋白基因表达量、海马CA1区骨架变化、超微结构、骨架及递质相关基因的变化及骨架抑制剂对RABV感染及复制的影响等方面进行了研究。研究结果表明，街毒株糖蛋白信号肽中心区域的结构为β折叠，且疏水值小于弱毒株和固定毒株；在街毒株感染的鼠脑中，G基因的拷贝数低于固定毒株，但在神经元原代细胞上，G基因表达量相近，体内、外结果说明，与免疫相关的基因，如Ccl5、Oas1a、Cxcl10、Ifit1、Ifi27/2a等的上调，与G基因的高表达正相关；体内外实验均证实，RABV对各种递质类型的神经元均能感染。通过免疫组化和G基因拷贝数检测同时证实，脑组织中抗原分布由高到低依次为：大脑皮层＞海马、脑干＞小脑＞丘脑＞嗅球；对海马CA1区检测发现，被感染神经元的胞体和树突完整，但树突棘数量减少，这种变化是由街毒株感染造成F-actin解聚引起；对感染组织和原代神经细胞的超微结构研究发现，神经元线粒体肿胀，嵴消失，高尔基体亢进，核周间隙扩大，突触体内出现含RABV的突触小泡；下列骨架及递质相关基因，如stmn1(下调) 、kif5b(下调)、klc1(下调)、APC(上调)、katna1 (上调)、mylk (上调)、gelsolin (上调)、Gsk3β(上调)的体内外变化变化趋势一致，Gelsolin和MLCK蛋白表达上调，推断其与细胞骨架破坏、递质传输及释放障碍有关；秋水仙碱和细胞松驰素D等细胞骨架抑制剂能破坏微管和微丝的结构并影响RABV的感染及复制。本研究还发现，我国弱毒疫苗株SRV9可应用于RABV街毒暴露后的预防。这些结果为揭示RABV致神经功能异常的机制补充了重要的实验数据，为RABV致细胞骨架破坏的机制研究奠定了重要基础。