尿道致病性大肠杆菌新基因R049的功能与定位的研究

尿道致病性大肠杆菌（UPEC）是尿路感染的首要致病菌，本项目在发现UPEC132株新基因R049的基础上，对其功能进行系统研究，并进行染色体定位。采用体外模拟人尿道条件培养UPEC132,从转录和翻译水平研究R049基因表达的规律,探求其生理代谢和致病机制。利用Red重组系统构建R049缺失株，并感染R049重组蛋白免疫及未免疫小鼠,采用基因芯片、Real-time PCR、细菌学、免疫学和病理学方法分析小鼠血、尿和肾脏组织标本,全面了解R049在细菌感染和免疫保护过程中的作用。应用免疫蛋白质组学方法，分析和阐明慢性肾盂肾炎小鼠对包括R049在内的外膜蛋白的免疫应答。利用GenomeWalker方法向R049上下游延伸,结合生物信息学分析,明确其染色体定位。本项目有利于致病机理研究深化，为开发抗感染治疗新策略奠定理论基础。

本项目按照研究计划完成全部研究内容。研究内容包括对尿道致病性大肠杆菌(UPEC)的新基因R049进行染色体定位，并对其在UPEC生理代谢和致病过程中的相关功能进行研究。利用染色体步移技术结合生物信息学分析，完成了基因R049的染色体定位，并发现了R049基因组岛（R049-GI），长度为20773bp，包含25个ORF，R049基因位于R049-GI的第13个ORF，是UPEC132通过水平基因转移获得的染色体基因组岛的组成部分。利用基因表达谱芯片及信号通路分析，发现UPEC132与其R049缺失株分别感染小鼠的肾脏有34个差异表达基因与宿主细胞的炎症和免疫信号通路相关，涉及MAPK信号通路，白细胞跨内皮迁移，细胞因子与其受体相互作用，TOLL样受体信号通路和细胞凋亡，表明R049基因表达对小鼠抗UPEC感染的早期天然免疫和炎症反应具有一定影响。利用双向凝胶电泳-免疫印迹技术，并结合质谱鉴定，建立了UPEC外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法，发现了不同培养条件下UPEC的外膜蛋白质组与慢性肾盂肾炎小鼠血清的免疫反应差异。模拟人体尿道环境体外培养UPEC132，利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测R049的转录调控水平，发现在人工高渗透压培养基和正常人尿中UPEC132的R049转录水平分别上调了7倍和3倍，表明R049基因的转录调控与培养环境中的渗透压变化有关。本项目为UPEC致病机理的研究深化和抗感染治疗新策略的开发奠定了理论基础。本项目在国内核心期刊发表论文1篇，综述1篇，还发表会议论文1篇，且获得会议优秀论文一等奖。