肠道外致病性大肠杆菌一新基因组岛的功能研究

新基因组岛GI22仅存于APEC和UPEC株中，而在非致病株和肠道致病株中都不存在，用构建的DNA芯片对APEC毒力基因的差异表达进行研究，结果显示GI22岛中的aes-13为上调基因，因此GI22基因组岛可能是ExPEC在肠道外环境中生存或引起肠道外感染所需要的。对于GI22岛在ExPEC感染中的功能与作用，需进行进一步的研究和确定。本研究拟以我国自行分离的APEC、UPEC分离株为对象，对代表性菌株GI22岛进行全长克隆、测序分析及其一系列突变株的构建，通过CBA/J或C57B1/6小鼠模型和SPF鸡感染模型，在体内、外试验中探究GI22岛在感染中的功能。并对分离株进行分子检测，结合流行病学资料，阐明GI22岛在ExPEC中的分布和流行规律，对进一步澄清其致病机理和研制有效疫苗奠定基础。

大肠杆菌是寄居在宿主肠道对宿主无害或者造成局部/全身感染的菌群之一。大肠杆菌可以分成三类：非致病性大肠杆菌、肠道致病性大肠杆菌和肠道外致病性大肠杆菌。肠道外致病性大肠杆菌（ExPEC）定植在肠道外，并可致全身感染。禽致病性大肠杆菌（APEC）属于ExPEC的成员，APEC引起禽的大肠杆菌病。在本研究中，对分离的APEC E058分离株进行血清型鉴定为O2。通过1日龄雏鸡接种107CFU，24h内致死率为100%，确定E058分离株为高致病株。通过克隆、测序和比对的方法，确定GI22基因组岛在APEC E058株中存在，而在K-12菌株中不存在。进而，对GI22基因组岛进行了序列分析和定位。运用一步PCR重组的方法成功构建了GI22全基因组岛的突变株，对突变株进行了LB中生长曲线测定、1日龄仔鸡致死性试验和35日龄SPF鸡体内分布和定植试验，结果均显示，突变株和野生株相比没有表现出显著的差异。对GI22基因组岛研究的同时，发现GI22基因组岛一翼基因smpB 和ssrA（组成tmRNA-SmpB 系统）。利用λ-Red系统，成功构建了APEC E058 的smpB 和ssrA基因缺失株、回复株，进行了多项体外及体内试验，评价其致病性，旨在探究该系统与APEC致病性之间的关系，为深入研究APEC的致病机理和特异性防制措施奠定基础。研究结果显示，在SPF鸡感染模型中，破坏smpB 或ssrA和同时破坏这两个基因，都可以显著降低 APEC E058的致病性，并且回复株的毒力表型能够得到回复（P < 0.02）。生长曲线分析表明，分别在37°C 和42°C的条件下，野生株、突变株、回复株在LB 培养基中的生长无显著差异。而且，通过定植和持续性感染试验表明，突变株毒力显著减弱。鸡巨噬细胞HD-11感染试验结果显示，突变株在HD11内繁殖和/或存活的能力降低。然而，在巨噬细胞HD-11吞噬试验和鸡血清抵抗能力方面没有表现出显著差异。这些数据表明，tmRNA-SmpB 系统对APEC O2 E058株的致病机制是至关重要的。