乙肝病毒对DNA 复制应激沉默效应的研究

乙肝病毒感染是原发性肝细胞癌（HCC）发生发展的重要危险因素之一，乙肝病毒的X基因（HBx）在其中发挥重要作用。HBx与基因转录、信号传导、表观遗传和细胞周期等调控过程密切相关。现已知以DNA损伤应答为基础的基因组监护机制在维持基因组稳定性，抑制突变积累和肿瘤发生过程中起到关键作用。我们已发现HBV能够抑制ATR介导的DNA复制应激检验点通路，其早期响应信号蛋白TopBP1的磷酸化程度明显减低，导致H2AX变体不能充分磷酸化，造成DNA复制叉不稳定和DNA双链断裂的产生。本研究将利用分子细胞生物学技术进一步阐明HBV及HBx蛋白干扰ATR通路早期激活和信号传导的分子机制，及此沉默效应在HBV复制和致癌过程中的作用，探索并行干预多条DNA损伤应答通路后HBV阳性肝癌细胞对放化疗的敏感性改变，以期为乙肝后肝癌的治疗提供全新的理论依据和策略。

本项目已圆满完成了设计的研究内容，取得了有价值的研究成果，达到国内相同研究领域先进水平。研究结果证实了三个方面的学术问题：一是HBV能抑制UV引起的ATR通路的活化，削弱G2/M检验点功能，所造成的基因组不稳定与CENP-F定位无关。在喜树碱（CPT）引起的DNA损伤应答中，携带有HBV基因组的肝癌细胞2215的单链DNA形成存在缺陷，其机制是使单链结合蛋白RPA32磷酸化缺陷，无法募集相关DNA修复蛋白到损伤位点，从而阻断ATR激活。二是在HepG2和293T细胞中过表达HBX，造成DNA损伤后RPA32，H2AX磷酸化均减弱，其机制是HBX通过与ATR信号通路早期蛋白Rad9分子相互作用，劫持Rad9功能，抑制RPA32磷酸化，从而抑制ATR激活。三是HBV能降低肝癌细胞对化疗药物的敏感性，在初步筛选出的杀伤HBV阳性肝癌细胞的DNA损伤应答通路的小分子探针中，效果最好的是CGK733（简称CK）。CK可增强HBV阳性肝癌细胞对紫杉醇的敏感性，增敏效率达2倍以上，其机制可能是CK能促进细胞快速通过紫杉醇引起G2/M期阻滞，导致有细胞丝分裂灾变而引起死亡。.此外，我们扩展延伸研究的两方面的实验结果还表明：①smu1基因编码的蛋白主要定位在细胞核，siRNA沉默smu1 基因表达后，细胞的生长增殖能力明显缺陷，对各种基因毒性因素的处理（x-ray、UV、CPT及Etopside）更加敏感，标志基因组损伤的γH2AX foci增多；用复制抑制剂HU及UV处理时，多个关键的DNA损伤反应（DDR）蛋白包括Chk1-S345, H2AX-S139, p53-S15及Cdc2 (Tyrosine 15)等过度表达，预示其细胞周期检验点过度活化，细胞凋亡亦显著增加。本研究结果可能为HCC的治疗提供了新靶点。②野生型p53激活剂Nutlin-3能使肝癌细胞DNA发生双链损伤，同时发生细胞凋亡和细胞周期阻滞；促使肝癌细胞中的野生型p53从细胞核部分移位至细胞质，这种移位与p53-Ser392磷酸化水平降低有关，为HCC的分子治疗提供了新的思路。