EB病毒介导细胞DNA应激沉默和端粒酶TCAB1转录激活的效应及信号调控

鼻咽癌(NPC)是我国常见的头颈部恶性肿瘤，EB病毒感染和病毒编码的潜伏膜蛋白1 (LMP1)与其发生发展密切相关。现已知以DNA损伤应答和端粒酶调控端粒为基础的基因组监护机制在维持基因稳定，抑制肿瘤发生中起关键作用。我们前期研究发现EBV感染能够抑制激酶ATR介导的DNA复制应激检验点通路，激活端粒酶卡侯体蛋白1（TCAB1）的高表达而延长端粒。本研究将从单链DNA结构的生成，复制叉稳定性，表征EBV对DNA复制应激早期激活的生化缺陷；阐明LMP1诱导基因组稳定性丧失的分子机理和作用ATR通路的分子靶点；并分析EBV激活TCAB1对端粒酶亚单位的调节和卡侯体定位的影响，探索EBV顺式激活TCAB1启动子可能性，寻找EBV参与调节TCAB1的信号途径，垂钓TCAB1作用的靶蛋白；进而深入研究ATR与TCAB1相互调控的关键节点，以期通过干预基因组稳定性应答途径进行EBV阳性鼻咽癌的治疗。

本课题紧密联系基础和临床，首次报道了TCAB1在临床鼻咽癌标本中的检出率， 约80%的鼻咽癌病人为阳性，而仅有20%的鼻咽炎病人为阳性；TCAB1在肿瘤细胞系中也有高表达，且TCAB1和DNA损伤标志蛋白γ-H2AX阳性率在EBV阳性及EBV阴性鼻咽癌组织中的表达有统计学差异。随后，我们创新性揭示了EB病毒对鼻咽癌细胞CNE1、CNE1-LMP1的TCAB1具有转录激活作用，并且能增加端粒酶活性和端粒长度，其激活的机制并未发现EB病毒直接参与调控TCAB1的启动子序列，而是可能增强了细胞DNA损伤修复反应。同时我们也采用免疫共沉淀-质谱手段解析与TCAB1相互作用的蛋白谱。进一步研究表明EBV能激活DNA损伤的ATR通路，诱导通路蛋白p-H2AX、p-ATR、p-RPA32、CHK1在短时间内呈上升的趋势，相反p-CHK1呈下降趋势。提示EBV能引起DNA损伤中ATR通路的高反应性，并能造成DNA损伤灶点的增多。EB病毒激活的TCAB1与ATR通路也具有相互作用，shRNA介导的TCAB1下调会加剧γH2AX灶点的数目增多,导致自发性DNA损伤的积累。最后，我们采用小分子物质shRNA作为头颈癌治疗的有效工具，体外实验显示TCAB1的缺失会降低头颈癌细胞的增殖能力，影响细胞周期，同时会降低细胞的体外侵袭能力。Microarray测定显示，TCAB1的缺失影响了肿瘤细胞发生发展进程中的多个通路。裸鼠的移植瘤实验显示，TCAB1缺失的细胞在相同条件下会形成显著减小的移植瘤，导致头颈癌细胞在体内的增殖能力显著降低，而凋亡能力则显著增强，且导致移植瘤组织中新生微血管的形成能力显著降低。但是雄裸鼠的实验结果正好相反，shTCAB1能促进移植瘤的生长，进一步我们将重复验证动物实验，深入发掘激素对TCAB1的影响。总之，EB对TCAB1和ATR的激活功能和调控机制的阐述为病毒学领域提供了新的宿主细胞-病毒相互作用的个例，并有可能揭示肿瘤学基因组稳定性机制，期望为EB病毒相关的鼻咽癌治疗开辟新的途径。